HIV原發(fā)感染者CD8+T細(xì)胞表面NK相關(guān)受體的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 人類(lèi)免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV）侵犯CD4+T細(xì)胞，使機(jī)體獲得性免疫功能?chē)?yán)重受損，最終可導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染或腫瘤。CD8+T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的效應(yīng)T細(xì)胞，經(jīng)抗原致敏后可以特異性殺傷攜帶致敏抗原的靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、病原微生物感染的細(xì)胞等。T細(xì)胞通過(guò)其表面的受體和CD4或CD8分子同抗原提呈細(xì)胞提呈的MHC-肽復(fù)合物結(jié)合從而傳導(dǎo)活化信號(hào)，進(jìn)而對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能。有研

2、究表明CD8+T細(xì)胞也可表達(dá)一些抑制性或活化性的NK相關(guān)受體（NKassociatedreceptors，NKR）當(dāng)它們識(shí)別其相應(yīng)的配體后，產(chǎn)生抑制或活化信號(hào)，進(jìn)而決定CD8+T細(xì)胞是否殺傷病原微生物感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。
　　 CD8+T細(xì)胞根據(jù)NK相關(guān)受體基因定位的不同可表達(dá)的受體類(lèi)型有：C型凝集素超家族受體（CD94/NKG2受體）、殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killercell-immno-globulin-likere

3、ceptor，KIR）。
　　 C型凝集素超家族中CD94/NKG2A為抑制性受體，NKG2A與CD94形成異二聚體，可以識(shí)別HLA-E，從而傳導(dǎo)抑制信號(hào)，可抑制CD8+T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷；NKG2D是一個(gè)重要的活化性受體，像其他NKG2類(lèi)家族的成員一樣是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，包含C型植物凝集素樣NK受體區(qū)域，CD8+T細(xì)胞NKG2D的功能是作為一個(gè)共刺激受體，NKG2D識(shí)別其相應(yīng)的配體傳導(dǎo)活化信號(hào)，可活化CD8+T細(xì)胞發(fā)揮對(duì)靶

4、細(xì)胞的殺傷功能。免疫球蛋白樣超家族抑制性受體KIR3DL1抑制了CD8+T細(xì)胞溶解靶細(xì)胞的活性。
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)的NK相關(guān)受體可調(diào)控CD8+T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的功能，是功能性受體標(biāo)志著T細(xì)胞發(fā)揮抗病毒抗腫瘤的能力。但迄今為止，尚無(wú)針對(duì)HIV原發(fā)感染期（PrimaryHIV-1infection，PHI）CD8+T細(xì)胞表面NK相關(guān)受體表達(dá)及對(duì)HIV抑制作用的相關(guān)研究，由于原發(fā)感染期患者獲得非常困難，故以往研究

5、都是針對(duì)HIV慢性感染者。我們首次對(duì)原發(fā)感染患者CD8+T細(xì)胞表面活化性和抑制性的NK相關(guān)受體表達(dá)進(jìn)行研究。以往國(guó)際上對(duì)于CD8+T細(xì)胞表面NK相關(guān)受體的研究多是單一的受體，而我們首次將活化性和抑制性受體進(jìn)行組合搭配研究，使不同細(xì)胞群功能研究的更為細(xì)致。
　　 方法：
　　 一、研究對(duì)象
　　 本研究對(duì)象為103例成人，其中未接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的61例HIV感染者，接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的20例HIV感染

6、者，與HIV感染者年齡相匹配的男性健康對(duì)照22例，上述HIV感染者均來(lái)自男男性接觸（Menwhohavesexwithmen，MSM）隊(duì)列。未接受抗病毒治療的HIV感染者年齡分布為21-54歲（29.8±7.6），可分為HIV原發(fā)感染者29例即PHI組（感染時(shí)間為6個(gè)月以?xún)?nèi)）、慢性HIV感染者19例即HIV組（CD4+T細(xì)胞介于200-500個(gè)/μl之間，無(wú)艾滋病指征性疾?。┖桶滩』颊?3例即AIDS組（CD4+T細(xì)胞<200個(gè)/μl

7、或出現(xiàn)艾滋病指征性疾?。?。接受抗病毒治療的HIV感染者20例即HAART組（經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的至少一年的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后，病毒RNA<400copies/ml，200個(gè)/μl≤CD4+T淋巴細(xì)胞<500個(gè)/μl），年齡分布為22-45歲（30.5±7.8）。健康對(duì)照組為22例隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人，年齡分布為24-60歲（29.46±7.48）。
　　 二、T細(xì)胞絕對(duì)值檢測(cè)
　　 T細(xì)胞絕對(duì)值檢測(cè)

8、完全依照1997年美國(guó)CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞檢測(cè)指導(dǎo)方法嚴(yán)格執(zhí)行，使用BD公司TruCOUNT管，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)MULTISET軟件分析結(jié)果。具體步驟如下：將20μlCD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，逆向加樣法加入50μlEDTA抗凝血，室溫避光15min，加入經(jīng)10倍稀釋BD公司的免洗溶血素450μl，室溫避光15min，樣本溶血徹底后FACSCalibur流式細(xì)胞儀

9、檢測(cè)，MULTISET軟件進(jìn)行分析，自動(dòng)生成CD3+T/CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的結(jié)果。
　　 三、CD8+T細(xì)胞表面NK相關(guān)受體NKG2D、NKG2A、KIR3DL1表達(dá)的檢測(cè)
　　 使用五色熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合CD3PE-Cy7/CD8Percp/NKG2DAPC/NKG2APE/CD38FITC和CD3PE-Cy7/CD8Percp/NKG2DAPC/KIR3DL1PE/CD38FITC對(duì)幾組研究對(duì)

10、象外周全血進(jìn)行表面染色，即每個(gè)研究對(duì)象均有兩個(gè)按上述不同組合染色的樣本管，另設(shè)一管同型對(duì)照管。樣本管內(nèi)均加入100μlEDTA抗凝全血，按上述兩種組合單抗分別加入樣本管內(nèi)，室溫避光25min后加入自制溶血素3mL，室溫避光8分鐘充分溶血后，300g離心10min，棄上清。加入3mLPBS進(jìn)行洗滌，室溫，300g離心10min，棄上清，共洗滌兩次。最終加入含有1％多聚甲醛的PBS200uL懸浮，BDFACSAria檢測(cè)，DiVaTM軟件進(jìn)

11、行分析。如下圖：P1為淋巴細(xì)胞，以P1為門(mén)，定義CD3+淋巴細(xì)胞，再以P2為門(mén)，定義出CD3+CD8+（P3），然后再分析CD8+T細(xì)胞表面各NK相關(guān)受體表達(dá)的百分含量季嗎，并且同時(shí)檢測(cè)表面活化受體、抑制受體表達(dá)水平。
　　 四、HIV病毒載量測(cè)定
　　 以500μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor1.5commercialkit在COBASAMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x上以RT

12、-PCR方法測(cè)定病毒載量。檢測(cè)范圍為400-750，000copies/ml。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全部數(shù)據(jù)表示用中位數(shù)±95％可信區(qū)間。各組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述，CD8+T細(xì)胞在抗擊病毒感染和腫瘤方面發(fā)揮重要的免疫監(jiān)督作用

13、。我們的研究發(fā)現(xiàn)HIV原發(fā)感染期開(kāi)始CD8+T細(xì)胞表面NKR：NKG2A、NKG2D表達(dá)就發(fā)生改變。NKG2D+NKG2A-CD8+T百分含量隨病毒載量升高而降低，CD8+T細(xì)胞NKG2D+NKG2A-表達(dá)的百分含量與CD4+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量呈正相關(guān)。NKG2A+NKG2D-CD8+T百分含量病毒載量升高而升高，CD8+T細(xì)胞NKG2A+NKG2D-表達(dá)的百分含量與CD4+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量呈負(fù)相關(guān)?？傻贸鼋Y(jié)論，HIV感染后隨著疾病的進(jìn)展