遼寧MSM人群HIV-1原發(fā)感染者病毒全基因組序列特征研究.pdf

1、目的：
　　 艾滋病是目前對(duì)人類社會(huì)威脅最大的傳染性疾病之一。由于HIV-1存在高水平的遺傳變異性，盡管抗病毒藥物已經(jīng)普遍應(yīng)用于艾滋病的治療，但多年來(lái)艾滋病的防治及疫苗的研究并未取得突破性進(jìn)展。最新評(píng)估報(bào)告表明，男男性傳播已成為HIV-1感染的重要傳播途徑，男男同性戀是我國(guó)今后要重點(diǎn)關(guān)注和防治的人群，而且我國(guó)人群的遺傳背景又與歐美及非洲人種明顯不同，其免疫應(yīng)答極有可能有新的特點(diǎn)。但目前我國(guó)對(duì)于男男同性戀人群感染HIV-1的分子流

2、行病學(xué)等研究還非常有限，針對(duì)我國(guó)男男同性戀中HIV-1感染者的疫苗和治療研究缺乏HIV病原學(xué)免疫學(xué)等基礎(chǔ)資料的支持，因此了解男男同性戀原發(fā)感染者體內(nèi)transmitted/founder virus的生物學(xué)和基因組特征及病毒進(jìn)化和傳播關(guān)系，是今后對(duì)于HIV-1高危人群開(kāi)展防治工作的必要前提。
　　 本研究選取21例我國(guó)遼寧省男男同性戀人群中HIV-1原發(fā)感染病例，采用SGA/S方法獲取病毒全基因組序列，從病毒全基因組水平分析男男

3、同性戀人群中HIV-1原發(fā)感染者的流行趨勢(shì)及感染早期病毒的遺傳變異水平，明確HIV-1感染早期毒株的病毒學(xué)特征，預(yù)測(cè)原發(fā)感染者早期Ⅰ型人類白細(xì)胞抗原限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位并分析其氨基酸多態(tài)性，分析與不同疾病進(jìn)展過(guò)程相關(guān)的免疫應(yīng)答特征，為我國(guó)HIV-1感染的預(yù)防、診斷、監(jiān)測(cè)和治療提供重要的數(shù)據(jù)支持。
　　 材料和方法：
　　 1、研究對(duì)象
　　 21例從2008年10月開(kāi)始對(duì)800例自愿接受咨詢檢測(cè)的遼寧MS

4、M高危人群隊(duì)列按1.5個(gè)月的隨訪頻率篩查出的原發(fā)感染病例。原發(fā)感染病例入選標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行血清學(xué)ELISA篩查實(shí)驗(yàn)和wB確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，對(duì)血清學(xué)檢測(cè)陰性者進(jìn)行集合PCR核酸檢測(cè)，滿足以下一項(xiàng)或多項(xiàng)條件者①在6個(gè)月內(nèi)HIV抗體開(kāi)始變陽(yáng)性者②HIV抗體陰性但HIV RNA陽(yáng)性者③HIV抗體弱陽(yáng)性但在兩周之內(nèi)可以重復(fù)并OD值較前次升高者④有早期HIV感染的臨床癥狀、HIV抗原陽(yáng)性及WB抗體檢測(cè)少于4條蛋白帶者。EDTA抗凝收集全血樣本，4小時(shí)內(nèi)分離血漿，

5、-80℃凍存。
　　 2、血漿樣本RNA的提取
　　 病毒載量大于104c/ml的血漿樣本，直接參照QLAamp（R）Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取病毒RNA。對(duì)于載量小于104c/ml的血漿樣本，先進(jìn)行富集（4℃，23600g離心1小時(shí)）以獲得濃度較高的血漿RNA，再參照QIAamp（）Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取RNA。以280ul血漿提取病毒基因組RNA，提取物

6、溶于60ul洗脫液中。
　　 3、逆轉(zhuǎn)錄
　　 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系基于SupcrScript（）Ⅲ Reverse Transcdptase Kit（invitrogen）說(shuō)明書(shū)，分兩段逆轉(zhuǎn)錄獲得HIV-1全長(zhǎng)基因組。
　　 4、SGA方法Nested-PCR
　　 對(duì)cDNA樣本進(jìn)行極限稀釋，根據(jù)泊松分布，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物陽(yáng)性率小于30％的cDNA稀釋度能夠確保每個(gè)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物中僅有單一樣本的可能性大于80

7、％。故本實(shí)驗(yàn)用Nuclease-Free Water倍比稀釋cDNA，每個(gè)稀釋濃度均做8個(gè)平行孔，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，直至擴(kuò)增陽(yáng)性孔少于3個(gè)，以保證每個(gè)孔中為單一模板擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　 PCR擴(kuò)增體系基于Platinum（）Taq DNA Polymerase High Fidelity Kit（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)，分兩段套式擴(kuò)增HIV-1 cDNA全長(zhǎng)基因組序列。
　　 5、測(cè)序及分析
　　 使用ABI

8、3130全自動(dòng)DNA測(cè)序分析儀，根據(jù)雙脫氧終止法用28個(gè)引物雙向測(cè)通HIV-1約9KB的近全長(zhǎng)基因序列。用Contig Express（vision 9.0）進(jìn)行原始的清理和全長(zhǎng)基因拼接，出現(xiàn)雙峰時(shí)，次峰超過(guò)主峰的一半，認(rèn)定該位置為混合堿基。用Bioedit（vision3.3）將序列與HIV DataBase中的參考序列定序進(jìn)行比較，轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，分析變異位置及有無(wú)規(guī)律性。用MEGA4.1軟件以Kimura雙參數(shù)方法構(gòu)建全長(zhǎng)、en

9、v和gag Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Maximum composite likelihood方法計(jì)算序列間的基因距離。
　　 6、細(xì)胞嗜性分析
　　 通過(guò)V3環(huán)特異的氨基酸并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)工具PSSM預(yù)測(cè)感染毒株的細(xì)胞嗜性，在V3環(huán)第11至25位氨基酸為S/GXXXGPGXXXXXXXE/D、帶正電荷的氨基酸（R/K/H）與帶負(fù)電荷的氨基酸（D/E）數(shù)目差小于5時(shí)，可判斷為CCR5；如果11和25位氨基酸為

10、R或Q、帶正電荷的氨基酸（R/K/H）與帶負(fù)電荷的氨基酸（D/E）數(shù)目差大于5時(shí)，可判斷為CXCR4。
　　 7、Env氨基酸及糖基化位點(diǎn)數(shù)目分析
　　 用Bioedit軟件結(jié)合網(wǎng)絡(luò)工具N-GlycoSite分析計(jì)算樣本Env蛋白各區(qū)氨基酸長(zhǎng)度多態(tài)性及糖基化位點(diǎn)數(shù)目。以RCSB Protein Data Bank蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的HIV-1蛋白三維立體結(jié)構(gòu)為模型利用網(wǎng)絡(luò)工具SWISS MODEL，構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)樣本的蛋白三維立體

11、構(gòu)象。
　　 8、HLA-Ⅰ限制性CTL表位的預(yù)測(cè)
　　 利用網(wǎng)絡(luò)工具IEDB Analysis Resource，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的患者HLA-Ⅰ等位基因分型信息，預(yù)測(cè)樣本的HLA-Ⅰ限制性CTL表位，選取其中IC50低于50nM的表位進(jìn)行多肽特征和變異分析。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SSPS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，病毒載量均轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)進(jìn)行比較。載量、CD4細(xì)胞數(shù)目、特殊氨基酸和糖基化位點(diǎn)數(shù)

12、等不符合正態(tài)分布，選取Spearman為相關(guān)參數(shù)進(jìn)行兩個(gè)變量相關(guān)分析，P<0.05為顯著相關(guān)；用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)Wilcoxon參數(shù)分析，P<0.05有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 一、SGA/S方法可以獲得原發(fā)感染者體內(nèi)HIV-1單一毒株。
　　 二、遼寧地區(qū)MSM人群HIV-1原發(fā)感染以CRF01AE亞型為主，此外還可見(jiàn)少數(shù)B及CRF07BC亞型，并且CRF01AE亞型中明顯分為兩個(gè)分支，分別與我省和東南沿

13、海HIV-1感染人群親緣關(guān)系近。
　　 三、遼寧地區(qū)MSM人群原發(fā)感染HIV-1 Env蛋白某些氨基酸長(zhǎng)度多態(tài)性及特殊位點(diǎn)的變異會(huì)改變蛋白結(jié)構(gòu)，影響免疫識(shí)別。
　　 四、在遼寧地區(qū)MSM人群中引起感染的HIV-1毒株以CCR5嗜性為主；也發(fā)現(xiàn)CXCR4嗜性毒株的傳播，但其病毒載量水平都相對(duì)較低。
　　 五、遼寧地區(qū)MSM原發(fā)感染者HIV-1早期預(yù)測(cè)到的HLA-Ⅰ限制性CTL表位變異明顯，在個(gè)別同源毒株感染的病例中