遼寧省MSM人群HIV感染者基因型耐藥以及與流行毒株相關(guān)的社會(huì)網(wǎng)絡(luò)特征研究.pdf

1、目的：
　　 近年來,中國艾滋病的流行呈快速上升趨勢(shì),并且正從高危人群向一般人群傳播。至2009年底,中國新發(fā)感染者中經(jīng)同性性傳播的比例已經(jīng)從2007年的12.2%上升至32.5%。2011年衛(wèi)生部評(píng)估報(bào)告顯示,中國78萬HIV感染者中,經(jīng)同性傳播占17.4%。MSM已成為我國HIM-1感染上升最快的人群。由于男男性行為(menwhohavesexwithmen,MSM)人群的多性伴、安全套使用率低、偶然性行為多等特征,使其成為

2、HIV感染與傳播的重點(diǎn)人群。已有研究對(duì)遼寧省MSM高危人群進(jìn)行研究,2006年沈陽MSM的HIV感染率5.7%,2008年則升至8.7%。MSM人群已成為遼寧省艾滋病感染的重要目標(biāo)人群。
　　 2003年我國開始對(duì)達(dá)到抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)的HIV-1感染者提供免費(fèi)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HighlyActiveAnti-RetroviralTherapy,HAART),顯著降低了艾滋病(AIDS)的發(fā)病率和死亡率。但在藥物的選擇壓力下,

3、HIM-1可能很快產(chǎn)生耐藥突變而對(duì)藥物產(chǎn)生抗性。2007年全國耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,我國接受HAART。治療人群中耐藥突變率逐年升高,已達(dá)到17%。耐藥突變株可在人群中廣泛傳播,導(dǎo)致后來的感染者在用藥前已經(jīng)對(duì)某藥物的耐受。由于MSM人群中HIV感染者在近5年增長迅速,該人群的耐藥發(fā)生率也可以從一定程度上反映我國HIV感染者中耐藥株的傳播情況。而新發(fā)急性感染者體內(nèi)較高的病毒復(fù)制水平能夠顯著的增加HHIV的傳播風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)MSM人群中HIV-1新發(fā)

4、急性感染者耐藥突變發(fā)生情況進(jìn)行研究,能直接反映耐藥株傳播的最新動(dòng)向。
　　 我國針對(duì)MSM人群丌展的主要研究大多數(shù)著眼于分子流行病學(xué)的研究,或者是針對(duì)個(gè)體的危險(xiǎn)行為,而對(duì)MSM人群進(jìn)行結(jié)合分子流行病學(xué)的社會(huì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分析極少。本研究針對(duì)遼寧省MSM人群既往感染者以及新發(fā)急性感染者的耐藥水平,以及該人群感染病毒株的流行情況進(jìn)行研究,并以之為基礎(chǔ)結(jié)合其人口學(xué)特征及行為學(xué)特征對(duì)其社會(huì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),從網(wǎng)絡(luò)層面了解我省MSM人

5、群HIV經(jīng)不同途徑傳播的風(fēng)險(xiǎn)以及該人群中耐藥株的傳播情況。
　　 方法：
　　 1、研究對(duì)象
　　 1.1.2005-2008年在本院艾滋病門診隨訪的遼寧省165例MSMHIV/AIDS患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為:(1)自報(bào)在過去的6個(gè)月內(nèi)與男性發(fā)生過口交和/或肛交性行為,(2)年齡≥18歲的男性。(3)提供書面知情同意。所有感染者均由本艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)蛋白印跡方法(WB)確認(rèn)。采集血樣時(shí)未接受任何抗艾滋病毒治療。

6、>　　 1.2.2009年1月-2011年12月,在遼寧省建立了1934例MSM高危人群的丌放性前瞻性隊(duì)列,隨訪發(fā)現(xiàn)新發(fā)急性感染者。新發(fā)急性感染者入選標(biāo)準(zhǔn):①抗體ELJSA檢測(cè)陰性,血漿HIV-1RNA檢測(cè)陽性:②抗體ELISA檢測(cè)陽性,WB檢測(cè)結(jié)果為陰性或不確定;③6個(gè)月內(nèi)HIV抗體陽轉(zhuǎn)的患者。上述①和②均經(jīng)隨訪證實(shí)血清WB檢測(cè)達(dá)到HIV-1陽性診斷標(biāo)準(zhǔn),滿足以上任一條件且未經(jīng)抗病毒藥物治療的感染者作為研究對(duì)象。所有接受采集樣本者均

7、簽署知情同意書。
　　 2、CD4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定
　　 20μlCD4/CD8/CD3TriTEST試劑加入TruCOUNT管中,加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免沈溶血素450μl,室溫避光15min,用FACSMMLTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析、計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。
　　 3、病毒載量測(cè)定
　　 以1ml血漿采用Roche公司COBASAmp

8、liPrep/COBASTaqMan全自動(dòng)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)測(cè)定病毒載量。檢測(cè)范圍為40-107copies/ml。
　　 4、病毒核酸提取
　　 以200μl血漿提取病毒基因組RNA,按照QIAampwholebloodMiniKit和QIAampViralRNAMiniKit說明書步驟提取DNA或RNA,提取物溶于100μl洗脫液中。
　　 5、耐藥株基因變異的測(cè)定
　　 RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR和

9、套式PCR方法,以外側(cè)引物對(duì):MAW-26(5'-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3'HIV-1HXB22027-2050nt)和RT-21(5'-CTGTATTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3'HIV-1HXB23509-3539nt);內(nèi)側(cè)引物對(duì):Pro-1(5'-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3'HIV-1HXB22147-2166nt)和RT4R(5'-CTTCTGTATATCATT

10、GACAGTCCAGCT-3'HIV-1HxB23300-3326nt)用于擴(kuò)增HIV-1蛋白酶編碼區(qū)1-99氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)1-240氨基酸。
　　 6、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
　　 取終產(chǎn)物5μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)Ultra-VioletProduct凝膠成像后與marker比對(duì),確認(rèn)所需片段,用QIAquikGelExtractionKit試劑盒純化基因片段。
　　 7、PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序

11、　　 將純化后的PCR產(chǎn)物,以Pro-1(正向):CAGAGCCAACAGCCCCACCA,RT-A(正向):GTTGACTCAGATTGGTTGCAC,RT-B(正向):CCTAGTATAAACAATGAGACAC,ProC1-down(反向)5'CCCTGCTGGGTGTGGTATTCC3',RT4R(反向)CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序使用美國AppliedBiosystem公

12、司的BigDyeTerminatorSequencing試劑盒和ABI377型DNA測(cè)序儀。
　　 8、基因型耐藥分析
　　 以VectorNT1910軟件中ContigExpress組件進(jìn)行序列拼接,參照測(cè)序譜圖進(jìn)行基因序列修訂后,將序列遞交美國斯坦福大學(xué)HIV耐約數(shù)據(jù)庫(http://hivdb.Stanford.edu/hiv/)在線分析耐藥變異的位置和種類。
　　 9、序列分析
　　 經(jīng)PCR擴(kuò)增

13、和測(cè)序得到HIV-1pol基因的基因序列片段,以VectorNTI軟件包中ContigExpress組件進(jìn)行序列拼接,然后將這些序列用Bioedit軟件包中CLUSTALW程序進(jìn)行序列排列比對(duì),并在核苷酸序列中人工引入gaps保持翻譯完整性。應(yīng)用Bioedit軟件處理原始核苷酸序列,參照測(cè)序譜圖進(jìn)行基因序列修訂后,翻譯為氨基酸序列。使mMega4.1軟件中Neighbour-joining方法,對(duì)耐藥隊(duì)列的序列數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,計(jì)算兩

14、個(gè)流行簇毒株的基因距離。
　　 10、統(tǒng)計(jì)分析
　　 使用EpiData3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行描述性分析、單因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用UCINET6.O社會(huì)網(wǎng)數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用NetDraw形成一維與二維數(shù)據(jù)分析圖。
　　 結(jié)果：
　　 1、遼寧MSM人群HIV既往感染者與新發(fā)急性感染者流行病毒亞型分析
　　 在MSM既往感

15、染者中,HIV-1CRF01_AE亞型占89.8%(140/156),其次為B亞型占7.0%(11/156),最后為CRF07_BC亞型占3.2%(5/156)。在67例HIV-1新發(fā)急性感染者樣品中,57例(85.0%)為CRF01_AE亞型,5例(7.5%)為B亞型,5例(7.5%)CRF07_BC亞型。
　　 2、遼寧MSM人群HIV既往感染者與新發(fā)急性感染者感染毒株及主要流行簇比較分析
　　 MSM人群新發(fā)急性感

16、染者CRF01_AE及CRF07_BC亞型毒株與本地區(qū)MSM人群中既往感染者毒株混雜在一起,共同形成兩支明顯的CRF01_AE業(yè)型流行簇與一支CRF07_BC亞型流行簇。兩組人群在CRF01_AE兩支流行簇在MSM人群中依舊是已CRF01_AE亞型為主,第二簇占有絕對(duì)優(yōu)辨。
　　 3、遼寧MSM人群HIV既往感染者與新發(fā)急性感染者基因型耐藥分析
　　 MSM人群HIV既往感染者對(duì)任意一種藥物發(fā)生耐藥的突變頻率達(dá)到3.2%

17、,其中針對(duì)蛋白酶抑制劑(Proteaseinhibitor,PI)的耐藥突變率為3.2%,主要發(fā)生在CRF01_AE亞型;而對(duì)于核苷類(nucleoside/nucleotidereversetranscriptaseinhibitor,NRTI)與非核苷類(non-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NNRTI)的藥物的耐藥突變僅為0.6%,而針對(duì)這兩種藥物的耐藥突變則均在B亞型感染者中出現(xiàn)

18、。在新發(fā)急性感染者中耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)到4例(6.0%)存在針對(duì)PI的主要耐藥突變位點(diǎn),均發(fā)生在CRF01_AE亞型病毒感染者,未檢測(cè)到針對(duì)核苷類與非核苷類藥物的耐藥突變。兩組人群中攜帶相同耐藥位點(diǎn)的樣本遺傳距離很近,聚集在一個(gè)流行簇內(nèi)。
　　 4、不同病毒亞型與毒株流行簇中感染者人口學(xué)因素與行為學(xué)因素特征
　　 感染CRF01_AE亞型的感染者較其他亞型的感染者年齡偏大(p=0.040),主要集中在30歲以上;感染CRF

19、01_AE亞型的感染者較其他亞型的感染者文化程度水平較低(p=0.047);所從事的也是一些收入水平較低的工作(p=0.040)。而在CRF01_AE亞型流行簇內(nèi)分析,結(jié)果雖未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,我們還發(fā)現(xiàn)一些有意義的變化趨勢(shì),如:發(fā)現(xiàn)流行簇Ⅱ中沈陽本地較多(p=0.075),從事低收入的工作較多(p=0.061);平均性伴數(shù)有多于流行簇Ⅰ的趨勢(shì)(p=0.085);同性性行為持續(xù)時(shí)間有短于流行簇Ⅰ的趨勢(shì)(p=0.059)。
　　 5、

20、MSM人群活動(dòng)場(chǎng)所的社會(huì)網(wǎng)絡(luò)特征
　　 研究使用Johnson'sHierarchicalClustering聚類法將MSM社會(huì)活動(dòng)網(wǎng)絡(luò)大小聚為2類,其中一類以互聯(lián)網(wǎng)為中心;另一類以非互聯(lián)網(wǎng)中心。互聯(lián)網(wǎng),浴池和公共廁所/公園是MSM活動(dòng)的主要的場(chǎng)所。CRF01_AE亞型感染者結(jié)識(shí)同性性伴的特征性場(chǎng)所,即公共廁所/公園;而互聯(lián)網(wǎng)則足非CRF01_AE亞型感染肯的主要活動(dòng)場(chǎng)所。攜帶耐藥突變的感染肯主要通過互聯(lián)網(wǎng)尋找同性性伴。

21、　　 結(jié)論：
　　 1.CRF01_AE亞型已成為遼寧省MSM人群既往感染者與新發(fā)急性感染者的主要病毒亞型,其中CRF01_AE毒株存在兩個(gè)主要的流行簇,流行簇Ⅱ是我省MSM人群中CRF01_AE亞型中的優(yōu)勢(shì)毒株。B亞型與CRF07_BC亞型只占少數(shù),CRF07_BC亞型形成另一流行簇。
　　 2.在遼寧省MSM人群中HIV既往感染者總的耐藥率為3.2%,對(duì)蛋白酶抑制劑耐藥率為3.2%,對(duì)核苷類與非核苷類藥物的耐藥率均

22、為0.6%。在新發(fā)急性感染者中的耐藥率(6.0%)較既往感染者(3.2%)有所增加,應(yīng)引起足夠重視。
　　 3.在遼寧省MSM既往感染者與新發(fā)急性感染者人群中,耐藥突變主要是針對(duì)P1類藥物,主要集中在CRF01_AE亞型毒株。
　　 4.CRF01_AE亞型成為我省MSM人群HIV感染者的主要流行亞型,主要是由于該毒株在我省較底層次的社會(huì)人群之中的流行較快,他們具有收入水平較低,自我保護(hù)意識(shí)較差,而且同性性行為史較長等風(fēng)