HIV-1表型耐藥以及基因型耐藥的檢測(cè)與分析.pdf

1、耐藥性HIV-1的流行呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),其診斷、檢測(cè)變得越來(lái)越重要。掌握HIV耐藥株的流行情況,對(duì)于其防控具有重要的指導(dǎo)意義。在HIV-1耐藥性的檢測(cè)方法中“重組假病毒表型耐藥性檢測(cè)方法”顯示出了較大的優(yōu)越性。但目前相關(guān)的檢測(cè)方法仍具有一定局限性,需要進(jìn)一步研究改進(jìn)。所以,本研究圍繞HIV-1耐藥性,從兩個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　 首先對(duì)HIV耐藥性檢測(cè)方法進(jìn)行研究。以重組假病毒為基礎(chǔ),構(gòu)建表型耐藥性檢測(cè)系統(tǒng),并進(jìn)行多方面驗(yàn)證。通過(guò)

2、對(duì)HIV—env基因缺陷的載體質(zhì)粒“pSG3△env”進(jìn)行酶切位點(diǎn)改造,構(gòu)建出參考假病毒株。將病人來(lái)源的HIV—11.5kb耐藥基因片段克隆到改造后載體中相應(yīng)的位置,構(gòu)建出重組克隆。將其與HIV envelope表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-env共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,構(gòu)建出16株具有單輪感染性的HIV耐藥性假病毒株。本研究選擇TZM-b1細(xì)胞作為重組HIV—1假病毒株感染的靶細(xì)胞。利用TZM-b1細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),對(duì)重組假病毒株以及

3、參考假病毒株進(jìn)行對(duì)12種抗病毒藥物的表型敏感性檢測(cè)。從可重復(fù)性、準(zhǔn)確性及有效性等方面對(duì)該檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證,并將假病毒表型耐藥性結(jié)果與基因型結(jié)果比較。表型結(jié)果顯示,16株假病毒對(duì)12種抗病毒藥物的表型敏感性實(shí)驗(yàn)共192個(gè),其中有41(21.4％)個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到FC值大于10；17(8.9％)個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到FC>100；與基因型結(jié)果比較,兩種耐藥性檢測(cè)結(jié)果基本相符。另外還有一些結(jié)果不符,對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行了具體分析。發(fā)現(xiàn),有3株假病毒在含有TAM類(lèi)

4、突變的同時(shí)還含有E44A和V118I突變,可能與假病毒對(duì)藥物3TC和FTC的FC值升高有關(guān)。另外,其中一株假病毒還多含有了突變T69D,該突變對(duì)可能對(duì)TAM突變有協(xié)同作用,增加AZT的耐藥性。突變位點(diǎn)H221Y出現(xiàn)在3株假病毒中,該位點(diǎn)的出現(xiàn)可能與NVP耐藥水平小幅下降有關(guān)。目前,這些突變位點(diǎn)的協(xié)同效應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。本研究構(gòu)建的假病毒表型耐藥性檢測(cè)系統(tǒng),結(jié)合了基因型和表型耐藥性檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn),能夠?qū)IV耐藥性進(jìn)行具體解釋?zhuān)辉撓到y(tǒng)采用

5、不含Lucifer‘s報(bào)告基因的質(zhì)粒作為HIV載體骨架,避免來(lái)自系統(tǒng)內(nèi)部的信號(hào)干擾,使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確；該系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究還對(duì)我國(guó)廣西壯族自治區(qū)耐藥性HIV—1的流行情況進(jìn)行初步研究。將該地區(qū)61例未經(jīng)治療干預(yù)的HIV-1感染者納入樣本。采用國(guó)際常用的引物及擴(kuò)增方法對(duì)其基因型耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,研究樣本的基因型包括CRF_01AE/亞型、B亞型、CRF07_BC、RF08_BC亞型。其中有8例(13.1

6、％)含有耐藥性突變,存在不同程度的對(duì)PIs及RTIs的耐藥情況:3株B亞型,3株CRF_01AE/亞型和2株CRF08_Bc亞型。樣本GX54、GX48耐藥程度最嚴(yán)重,對(duì)多種PIs及RTIs都高度耐藥。GX54含有主要蛋白酶突變L90M,9個(gè)核苷類(lèi)TAM耐藥突變組合,以及3個(gè)主要的非核苷類(lèi)耐藥突變；GX48含有6個(gè)核苷類(lèi)TAM耐藥突變組合,和1個(gè)主要的非核苷類(lèi)耐藥突變。其余6個(gè)耐藥性樣本含有至多兩種主要耐藥突變,僅有低度的對(duì)RTIs的耐

7、藥性存在。另外,本研究還對(duì)該樣本蛋白酶1-99個(gè)氨基酸、逆轉(zhuǎn)錄酶1-225個(gè)氨基酸的基因多態(tài)性進(jìn)行分析。非耐藥性氨基酸突變位點(diǎn)分析結(jié)果顯示:在蛋白酶氨基酸序列中,有13個(gè)氨基酸替換率大于10％的位點(diǎn)；在逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列中,有15個(gè)氨基酸替換率大于10％的位點(diǎn)。兩個(gè)酶中最活躍、氨基酸替換率最高(>40％)的位點(diǎn)各有2個(gè)和7個(gè)。耐藥性氨基酸突變位點(diǎn)分析結(jié)果顯示:該樣本中突變率最高的位點(diǎn)主要集中在TAMs類(lèi)突變上,其中69和215位點(diǎn)均存在