HIV耐藥基因檢測平臺的建立——HIV耐藥基因的克隆，HIV病毒樣顆粒的制備及分子檢測方法的建立.pdf

1、艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的傳染病，自從1981年第一例病例報道以來，全世界已有超過7000萬的人口感染了該種病毒，其中超過三分之一死于該種疾病。盡管目前已經(jīng)有很多抗艾滋病藥物應(yīng)用于臨床治療，但是這些抗病毒藥物均有耐藥株產(chǎn)生。因此，作為幫助臨床醫(yī)生選擇聯(lián)合用藥方案的重要工具，耐藥性的檢

2、測就顯得十分重要。目前HIV耐藥檢測方法主要有表型檢測和基因型檢測。本研究的目的在于建立一種敏感性高、特異性好，檢測時間短、費用低，并且能夠檢測出病毒變異混合株百分比的基因型檢測方法。該方法的建立可以使臨床醫(yī)生及時了解患者的HIV耐藥性，從而為HIV治療方案的選擇提供有益參考。 由于HIV耐藥株不易獲得，并且在實驗過程中危險性很大，對實驗室的安全性要求很高，本課題擬在體外建立HIV耐藥突變庫，從而為HIV耐藥檢測平臺的建立提供檢

3、測模板。通過對HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因進(jìn)行基因克隆和定點突變，最終獲得了四個含有RT基因耐藥突變熱點的cDNA克隆。 此外，本課題運用基因克隆的方法將MS2噬菌體1.7kb片斷插入pET28a表達(dá)載體中，構(gòu)建了一個新的重組表達(dá)載體。該載體可作為耐核糖核酸酶(RNase)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品制備的通用載體平臺，以促進(jìn)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的研究。實驗中將HIV病毒RT基因插入該重組表達(dá)載體中，通過誘導(dǎo)表達(dá)構(gòu)建了含有RT基因的R

4、NA病毒樣顆粒。由于該病毒樣顆粒組成與HIV病毒相似，且無感染性，因此可以用來代替HIV耐藥株完成從病毒RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)到TaqMan實時PCR整個檢測過程，從而對所建立的HIV耐藥檢測體系進(jìn)行驗證。 最后本課題選擇了RT基因上的兩個耐藥突變熱點Q151M和Y181C進(jìn)行耐藥檢測方法的研究。針對這兩個耐藥位點的序列特異性，分別設(shè)計了普通型TaqMan探針和TaqMan-MGB探針，運用TaqMan實時PC

5、R法進(jìn)行檢測。通過對TaqMan實時PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終建立了一套能夠很好地區(qū)分耐藥突變的TaqMan實時PCR反應(yīng)體系。與傳統(tǒng)的HIV耐藥檢測方法相比，本課題所建立的TaqMan實時PCR法具有以下優(yōu)點：1．靈敏度高、特異性好；2．檢測時間短、費用相對較低；3．可以對野生型與耐藥突變型的混合樣品進(jìn)行檢測；4．可以檢測出混合樣品中的野生型與突變型各自所占的百分比；5．可以實現(xiàn)高通量檢測。該方法的建立為HIV耐藥檢測方法的研究提供了