不同亞型HIV-1假病毒顆粒共-超感染研究方法的建立及MazF抗體的制備.pdf

1、人類免疫缺陷病毒1型屬于高變異和高重組力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前全球AIDS的流行主要為M群造成，其主要包括11個(gè)亞型和51種流行重組型(CirculatingRecombinantForms，CRFs)。分析51種CRFs發(fā)現(xiàn)，有些亞型比其它亞型更容易參與到CRFs中，暗示不同亞型HIV-1可能具有不同的重組潛力。眾所周知，不同亞型共/超感染是重組發(fā)生的前提。為檢測(cè)不同亞型的共/超感染能力是否存在差異，我們建立了一種可以檢測(cè)HIV-1不同亞

2、型共/超感染潛力的方法，即構(gòu)建六種不同HIV-1亞型(A、B、C、D、G、CRF-01_AE)囊膜蛋白的重組載體。此外，我們還經(jīng)俄亥俄州大學(xué)武力教授饋贈(zèng)獲得分別攜帶紅色熒光蛋白(Redfluorescentprotein，RFP)和綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)并缺失Env及Nef的HIV-1缺陷型載體(pHIV1-eGFP/pHIV1-RFP)。通過將囊膜蛋白表達(dá)載體與HIV-1缺陷型載體共轉(zhuǎn)染

3、HEK293T細(xì)胞，包裝出12種單次感染的HIV-1假病毒顆粒。將假病毒顆粒濃縮，感染2×104HUT/CCR5細(xì)胞，72小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)20-30％的細(xì)胞呈現(xiàn)熒光。為驗(yàn)證假病毒顆粒是否可用于共感染潛力分析，分別隨機(jī)選取攜帶GFP或RFP不同亞型的HIV-1單次感染假病毒顆粒感染2×104HUT/CCR5細(xì)胞，72小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各亞型均呈現(xiàn)出不同程度的雙感染細(xì)胞，表明這些細(xì)胞會(huì)被兩種病毒粒子

4、所感染。為繼續(xù)驗(yàn)證假病毒顆粒是否可以對(duì)超感染進(jìn)行研究，分別選取共感染中所用亞型攜帶GFP的HIV-1單次感染假病毒顆粒感染HUT/CCR5細(xì)胞，8小時(shí)后加入帶有RFP的另一亞型假病毒顆粒再次感染，72小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，相比于共感染，在2個(gè)超感染處理組中未發(fā)現(xiàn)雙感染細(xì)胞，其他亞型間均存在超感染現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示，我們所建立的方法可以用于檢測(cè)HIV-1共感染及超感染的潛力。
　　 從1983年發(fā)現(xiàn)至今，AIDS已在全球范

5、圍內(nèi)流行了30年，但是，到目前為止沒有一種疫苗能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫。我們?cè)O(shè)想使用一種帶有毒素蛋白的逆轉(zhuǎn)錄載體來研制治療性HIV-1疫苗，當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞之后，會(huì)表達(dá)毒素蛋白并且降解HIV-1基因組RNA。MazF是大腸桿菌中可以特異切割mRNA中的ACA位點(diǎn)的一種毒素蛋白，在HIV-1基因組中有超過240個(gè)ACA位點(diǎn)，因此，HIV-1基因組所編碼的mRNA也能被MazF有效剪切。所以對(duì)于制備治療性HIV-1疫苗，MazF是一個(gè)很

6、好的備選蛋白。由于MzaF能剪切自身編碼的mRNA，因此為了提高M(jìn)azF的表達(dá)量，我們對(duì)mazF基因中的9個(gè)ACA位點(diǎn)進(jìn)行同義突變?？寺≈羛ET28a載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21菌株中，篩選出陽性克隆并測(cè)序正確。IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在約13kDa處能觀察到MazF的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化后作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得MazF蛋白的多克隆抗血清，通過免疫印跡法分析，證實(shí)MazF多克隆抗血清制備