基于假病毒的人乳頭瘤病毒小鼠感染模型的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌和尖銳濕疣等疾病的主要因素，如何預(yù)防與治療HPV引起的疾病已成為世界性的課題。HPV預(yù)防性疫苗是目前公認(rèn)的預(yù)防宮頸癌和尖銳濕疣發(fā)生的最有效手段。目前評(píng)價(jià)HPV疫苗保護(hù)性的主要標(biāo)準(zhǔn)是利用HPV假病毒檢測(cè)免疫后的血清中是否含有高滴度的中和抗體，而產(chǎn)生的中和抗體是否具有可靠的保護(hù)性，這些數(shù)據(jù)在臨床中較少。因此為了證明HPV疫苗是否能有效的預(yù)防人乳頭瘤病毒的感染，需要合適的動(dòng)物模型對(duì)疫苗的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2、　　 HPV嚴(yán)格的種屬特異性和組織特異性給HPV體外大量培養(yǎng)帶來了極大的困難。研究發(fā)現(xiàn)通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得的HPV假病毒與真病毒具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染性，這些特征促使HPV假病毒替代真病毒構(gòu)建動(dòng)物感染模型。
　　 本研究將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的HPV16L1&L2質(zhì)粒和熒光素報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒通過PEI方法共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，72小時(shí)后收集裂解細(xì)胞，收獲假病毒，利用活體成像儀對(duì)假病毒滴度進(jìn)行測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的質(zhì)量及純度

3、直接影響著假病毒的滴度，因此為了保證實(shí)驗(yàn)中生產(chǎn)的假病毒可以滿足檢測(cè)需要，本研究通過摸索建立了質(zhì)粒純化及質(zhì)粒質(zhì)量檢測(cè)的方法:利用Sepharose6FF和SOURCE30Q柱層析兩步法純化質(zhì)粒，純化后的質(zhì)粒使用Q sepharose TM FastFlow柱層析檢測(cè)ocDNA和ccDNA的量和G3000檢測(cè)純度。
　　 本研究又對(duì)HPV假病毒進(jìn)行了深入的研究，通過HPV16雙抗夾心系統(tǒng)檢測(cè)出利用293FT細(xì)胞生產(chǎn)出的HPV16假病

4、毒的濃度為12μg/ml，Western-Blot驗(yàn)證了假病毒中含有HPVL1&L2蛋白;為了研究HPV假病毒的結(jié)構(gòu)，本文摸索了假病毒的純化方法，確定了Superose6 prep grade柱層析結(jié)合Capto core700兩步純化假病毒的方法，可以達(dá)到較好的純化效果，純化后的假病毒在透射電鏡視野下可以觀察到大量直徑為60nm的假病毒顆粒，為假病毒結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究將HPV16L1&L2和Luc報(bào)告基因質(zhì)粒通

5、過PEI共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，獲得包裹Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒，利用活體成像儀檢測(cè)HPV16假病毒滴度。通過注射醋酸甲羥孕酮使實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)入動(dòng)情間期，壬苯醇醚-9(N-9)化學(xué)損傷其陰道，繼而進(jìn)行HPV16假病毒攻毒感染并用活體檢測(cè)儀檢測(cè)小鼠陰道中熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)情況。成功建立假病毒感染小鼠模型后，本研究又進(jìn)行了假病毒滴度與最低感染劑量關(guān)系的摸索。為了將此模型應(yīng)用于疫苗保護(hù)性檢測(cè)，本研究又將HPV16疫苗分三種劑量免疫小鼠，

6、免疫6周后利用HPV16假病毒小鼠感染模型評(píng)價(jià)HPV16疫苗的保護(hù)性，檢測(cè)結(jié)果顯示最低劑量(22ng)免疫的小鼠產(chǎn)生的中和抗體完全可以抵御HPV16 PsV的感染，表明了該假病毒感染模型具有較好的實(shí)際應(yīng)用性。
　　 綜上所述，本研究成功地摸索出質(zhì)粒純化與質(zhì)控及HPV假病毒顆粒純化的方法，為穩(wěn)定生產(chǎn)HPV假病毒和假病毒的低溫電鏡結(jié)構(gòu)、L1&L2相互作用研究奠定了基礎(chǔ);本研究建立的HPV假病毒小鼠感染模型，為HPV感染干預(yù)研究、致病