家鼠及野鼠攜帶乙腦病毒調(diào)查和乙腦病毒感染NIH小鼠模型的建立.pdf

1、目的：
　　流行病乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)，又稱為日本腦炎，簡稱乙腦。我們赴福建省和廣東省采集家鼠和野鼠的樣本，檢測其是否攜帶乙腦病毒，并且建立乙腦病毒感染的小鼠模型，檢驗(yàn)其攜帶乙腦病毒的能力。
　　方法：
　　1、家鼠和野鼠樣本的采集
　　2013-2015年在廣州市以及廈門市部分公園、醫(yī)院、農(nóng)貿(mào)市場、學(xué)校等地方捕鼠。鼠籠放置的地點(diǎn)主要有建筑墻角、下水道、草叢、垃圾桶旁等。心

2、臟采血處死，無菌開顱，取出部分腦組織。血液樣本靜置1h后，3500g/min離心15min，分離出上層血清。采集的標(biāo)本置于，-80℃冰箱保存，待檢。
　　2、家鼠和野鼠腦組織樣本乙腦病毒的檢測
　　采用Roche High Pure viral RNA kit提取鼠腦組織病毒RNA，用RocheTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA

3、為模板，利用熒光定量RT-PCR法和普通RT-PCR法檢測腦組織中的乙腦病毒。
　　3、家鼠和野鼠血清樣本乙腦病毒抗體的檢測
　　采用間接ELISA檢測鼠血清樣本乙腦病毒IgG抗體，將陽性樣本用病毒中和實(shí)驗(yàn)測定中和抗體滴度，然后，用間接ELISA檢測鼠血清樣本登革病毒IgG抗體，排除登革感染。
　　4、乙腦病毒感染NIH小鼠模型的建立
　　4.1病毒株:本研究使用的2株乙腦病毒株均屬于GⅢ型，GD乙腦病毒株于20

4、09年廣東地區(qū)的大足鼠耳蝠腦組織中分離、鑒定并保存，NAK株(Nakayama株，中山株)乙腦病毒是首次從日本乙腦病人體內(nèi)分離的乙腦病毒株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。病毒株通過顱內(nèi)接種3日齡乳鼠進(jìn)行病毒擴(kuò)增，將病毒過濾液感染BHK-21細(xì)胞，制成病毒液，并測定TCID50。
　　4.2乙腦病毒株半數(shù)致死量測定:分為2個(gè)病毒株組(NAK組和GD組)，每個(gè)組分為6個(gè)劑量小組(100～105 TCID50/100μL)，每個(gè)劑量小組有6只NIH小

5、鼠，雌雄各半，5～6周齡，共用72只小鼠。設(shè)立1個(gè)對照組，共6只小鼠。將原病毒液稀釋成100～105 TCID50/100μL6個(gè)濃度梯度。采用腹腔注射的方式，按不同的濃度梯度分組，每只小鼠100μL。對照組給予每只小鼠100μL PBS溶液。注射乙腦病毒后，共觀察21天。將發(fā)病死亡的小鼠無菌解剖，取腦組織進(jìn)行乙腦病毒檢測。將不發(fā)病小鼠在感染病毒后21天眼球取血、處死，檢測血清乙腦病毒中和抗體。
　　4.3乙腦病毒感染小鼠:分為2

6、個(gè)病毒株組(NAK組和GD組)，每個(gè)病毒株組有30只小鼠，雌性，5～6周齡，共用60只小鼠。設(shè)立1個(gè)對照組，共15只小鼠。
　　(1)初次感染:采用腹腔注射的方式，按不同的病毒株組，給予每只小鼠乙腦病毒毒力為103 TCID50/100μL，100μL。對照組給予每只小鼠100μLPBS溶液。病毒組分別在感染后4、7、8、10、11、12、13、14、17d剖殺1-3只小鼠，對照組在相同的時(shí)間剖殺1只小鼠，下頜下取血后處死，并分離

7、出上層血清。無菌解剖后取腦、肝、脾樣本。檢測小鼠血液、腦、肝、脾乙腦病毒的檢測，檢測小鼠血清乙腦病毒中和抗體。
　　(2)再次感染:初次感染35d后，將存活的小鼠進(jìn)行再次感染，NAK組、GD組注射病毒毒力和劑量如前，對照組腹腔注射NAK株乙腦病毒，103 TCID50/100μL，100μL。再次感染后，觀察小鼠的死亡情況，分別在再次感染后7、14、21d下頜下取約500ul血液。再次感染21d取血后，處死全部小鼠。檢測小鼠血清乙

8、腦病毒中和抗體。
　　4、質(zhì)量控制
　　(1)移液槍頭、凍存管、EP管等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性用品;
　　(2) RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄所用的容器和試劑如移液槍頭、EP管等，均事先進(jìn)行DEPC水處理，防止環(huán)境中RNA酶的污染;
　　(3)細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作均在細(xì)胞培養(yǎng)間的超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，防止污染;
　　(4)鼠的解剖在無菌間生物安全柜進(jìn)行，全程戴帽子、口罩和手套，做好個(gè)人防護(hù)工作;
　　(5)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格設(shè)立

9、陰、陽性對照及空白對照;
　　(6)鼠的血清采集和保存應(yīng)嚴(yán)防細(xì)菌污染。
　　結(jié)果：
　　1、家鼠和野鼠樣本采集的基本情況
　　本次研究在廣州市和廈門市部分地區(qū)共采集了198只鼠，包括褐家鼠(Rattus norvegicus)159只，黃毛鼠(Rattus lossea Swinhoe)27只，黃胸鼠(Rattusflavipectus)10只，小家鼠(Mus musculus Linnaeus)2只。共獲188

10、份鼠腦組織樣本，96份鼠血清樣本。
　　2、家鼠和野鼠腦組織樣本乙腦病毒的檢測
　　采用熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR對188份腦組織樣本進(jìn)行乙腦病毒的檢測，結(jié)果均為陰性。
　　3、家鼠和野鼠血清樣本乙腦病毒抗體的檢測
　　對采集的96份鼠血清樣本進(jìn)行乙腦病毒IgG抗體檢測，結(jié)果顯示45.8％(44/96)血清樣本為陽性。廣州市和廈門市鼠乙腦病毒IgG抗體檢測率分別為44.1％(15/34)，46.0％(

11、29/62)。對上述乙腦病毒IgG抗體陽性的44份血清樣本進(jìn)行乙腦病毒中和抗體滴度測定，由于有8份樣本血清量不足，只對36份樣本進(jìn)行了病毒中和試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，61.5％(24/39)血清樣本為乙腦病毒中和抗體陽性（抗體滴度≥1∶10），中和抗體滴度為1∶10～56。對上述乙腦病毒IgG抗體陽性的44份血清樣本進(jìn)行登革病毒IgG抗體，ELISA結(jié)果顯示，這些血清樣本均未登革病毒IgG抗體，可排除登革病毒的感染。
　　4、乙腦病毒

12、感染NIH小鼠模型的建立
　　4.1小鼠感染乙腦病毒后的癥狀:NAK株病毒組中，小鼠初次感染乙腦病毒8d后，開始發(fā)病，出現(xiàn)弓背后肢癱瘓、震顫、行動(dòng)遲緩、眼眶出血等癥狀，感染14d后，剩余的小鼠沒有發(fā)生發(fā)病或死亡。GD株病毒組中，小鼠初次感染乙腦病毒7d后，開始發(fā)病，出現(xiàn)上述類似的癥狀。對照組中，沒有小鼠死亡。
　　4.2乙腦病毒株半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:NAK株病毒組中，100～105 TCID50/100μL小組小鼠死亡的數(shù)

13、量分別為3、1、4、1、3、5，GD株病毒組中分別為0、2、4、5、1、5。由于各劑量小組小鼠死亡數(shù)量沒有規(guī)律，無法計(jì)算乙腦病毒株的半數(shù)致死量。2個(gè)病毒株組中，小鼠血清中和抗體平均滴度隨著病毒毒力的上升而升高。本研究選定103TCID50/100μL作為乙腦病毒感染小鼠實(shí)驗(yàn)的毒力濃度。
　　4.3小鼠初次感染乙腦病毒結(jié)果:
　　(1)小鼠血清樣本中乙腦病毒檢測結(jié)果:NAK病毒株組，感染后8d、10d、11d小鼠血清為乙腦病毒

14、陽性，病毒載量為3.8×101～1.6×104 copies/mL。GD病毒株組，可在感染后4d、7d、10d、11d、14d小鼠血清檢測出乙腦病毒陽性，病毒載量為0.7～9.8×102 copies/mL。
　　(2)小鼠腦組織樣本中乙腦病毒檢測結(jié)果:NAK病毒株組，感染后4d、7d、8d、10d、11d、14d小鼠腦組織標(biāo)本中檢測出乙腦病毒陽性，病毒載量為7.25×105～1.70×109 copies/mL。GD病毒株組，可

15、在感染后4d、7d、8d、10d、11d小鼠腦組織標(biāo)本中檢測出乙腦病毒陽性，病毒載量為6.7～7.4×108 copies/mL。
　　(3)小鼠脾組織樣本中乙腦病毒檢測結(jié)果:NAK病毒株組，運(yùn)用熒光定量在感染后4d、11d小鼠脾臟組織中檢測出乙腦病毒陽性，病毒載量為2.2～13.5copies/mL。GD病毒株組，可在感染后4d、8d、10d小鼠脾臟組織中檢測出乙腦病毒陽性，病毒載量為0.3～84.9 copies/mL。

16、>　　(4)小鼠肝組織樣本中乙腦病毒檢測結(jié)果:NAK病毒株組，GD病毒株組，對照組未在小鼠肝臟樣本檢測出乙腦病毒。
　　(5)小鼠血清乙腦病毒中和抗體檢測結(jié)果:小鼠初次感染乙腦病毒后，NAK、GD病毒株組乙腦病毒中和抗體滴度隨時(shí)間的變化呈上升的趨勢，NAK病毒株組從10d開始，血清乙腦病毒中和抗體滴度大于1∶20，GD病毒株組從11d開始，中和抗體大于1∶20，而對照組小鼠的中和抗體均未檢出。
　　4.4小鼠再次感染血清乙腦

17、病毒結(jié)果
　　(1)小鼠死亡情況觀察:對照組注射乙腦病毒8d后，開始有小鼠發(fā)病死亡，癥狀如前，觀察結(jié)束后，對照組有3只小鼠存活。NAK組、GD組未見小鼠發(fā)病死亡。
　　(2)小鼠再次感染后血清乙腦病毒中和抗體檢測:小鼠再次感染乙腦病毒后，NAK組和GD組在感染后7d抗體滴度均大于1∶300，中和抗體滴度隨時(shí)間的變化，呈下降的趨勢。對照組感染乙腦病毒14d后，中和抗體滴度大于1∶20，中和抗體滴度隨時(shí)間的變化，呈下降的趨勢。<

18、br>　　結(jié)論：
　　1、廣州和廈門地區(qū)家鼠及野鼠鼠腦組織中未分離出乙腦病毒，而血清中攜帶較高的乙腦病毒抗體，提示曾感染乙腦病毒。本研究提示對鼠在乙腦傳播中的作用值得進(jìn)一步研究。
　　2、小鼠對人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙腦病毒株均易感，并出現(xiàn)與乙腦病人相似的癥狀。小鼠感染人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙腦病毒株后，出現(xiàn)病毒血癥，并存在中和抗體和病毒共存的時(shí)期，具備潛在的傳播乙腦病毒的能力。高滴度的中和抗體對小鼠