免疫缺陷小鼠人偏肺病毒感染特點.pdf

1、PARTⅠ：重慶地區(qū)嬰幼兒重癥肺炎常見呼吸道病毒病原分析
　　 目的：了解重慶地區(qū)嬰幼兒重癥肺炎中常見呼吸道病毒感染及其協(xié)同感染情況。
　　 方法：2006年12月至2008年3月，于ICU病房收集診斷為重癥肺炎患兒的深部氣道或機械通氣氣管導管內(nèi)吸取物標本119份，采用RT-PCR或PCR方法檢測人偏肺病毒（hMPV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、博卡病毒（hBoV）、腺病毒（ADV）、副流感病毒（PIV）1、2、3和流感

2、病毒（IV）A、B等呼吸道病毒病原。
　　 結(jié)果：119份標本中病毒總檢出例數(shù)為86例（72.3％），其中RSV檢出率最高，為41.2％（49/119）；hMPV為19例（16.0％）。有2種及以上病毒協(xié)同感染23例，占26.7％（23/86）；RSV陽性中有19例存在協(xié)同感染，占38.8％（19/49）；hMPV為8例42.11％（8/19）。69例行細菌檢測，其中53例為陽性，陽性率為76.1％。這69例標本中，病毒陽性率為

3、76.8％；病毒細菌雙陽性為41例，占59.4％。
　　 結(jié)論：（1）病毒感染是重慶地區(qū)嬰幼兒重癥肺炎的重要病因。（2）RSV是嬰幼兒重癥肺炎最常見病毒病原，其次為ADV和hMPV。（3）病毒的協(xié)同感染在重癥呼吸道患兒中可能較為普遍，但尚無證據(jù)說明病毒協(xié)同感染可加重病情。
　　 PARTⅡ：綠色熒光標記重組偏肺病毒空斑形成滴度測定方法的建立
　　 目的：建立用于綠色熒光標記的重組人偏肺病毒（GFP-rhMPV）空

4、斑形成滴度測定方法。
　　 方法：基因組中插入綠色熒光蛋白基因的hMPV全序列cDNA質(zhì)粒和主要蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入包裝細胞293T后獲得感染性重組hMPV。GFP-rhMPV在Vero-E6細胞中連續(xù)傳代提升病毒滴度并保存。將等倍稀釋的重組病毒液接種常規(guī)制備的Vero-E6細胞單層，用含或不含胰酶的低熔點瓊脂糖凝膠覆蓋細胞，孵育一定時間后，熒光顯微鏡下計數(shù)熒光空斑數(shù)和免疫染色兩種方法同時進行，計算空斑形成單位。
　　 結(jié)

5、果：感染后3天，GFP-rhMPV可在低熔點瓊脂糖凝膠覆蓋層下形成分界較為清晰的綠色熒光集落，接種后3天熒光空斑相對獨立，便于計數(shù)。此前拯救獲得的重組hMPV在宿主細胞Vero-E6中的復制滴度可達1×106以上。
　　 結(jié)論：成功建立了GFP-hMPV的空斑形成實驗滴度定量檢測方法，為hMPV的致病機制、防治手段研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 PARTⅢ：BALB/C和SClD小鼠人偏肺病毒的感染特點
　　 目的：比較

6、研究BALB/C小鼠和SCID小鼠hMPV感染的特點，為hMPV感染免疫發(fā)病機制及疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：GFP-rhMPV滴鼻感染BALB/C小鼠和SCID小鼠，于感染后3、5、7、9、14天處死小鼠并無菌獲取心、肝、脾、肺、腎和腦用于病毒分離和病理檢查，空班形成法檢測病毒滴度，RT-PCR和Real-timePCR法檢測hMPV mRNA表達。
　　 結(jié)果：GFP-rhMPV滴鼻感染BAL，B/C小鼠和SCI

7、D小鼠后第5天肺組織分離到病毒。感染GFP-rhMPV的BALB/C和SCID小鼠在感染后第5天肺組織病毒滴度達峰值，（5.25±1.69）×104 PFU/g和（5.83±1.21）×105 PFU/g，SCID小鼠在感染后第14天肺組織內(nèi)病毒滴度仍可達（4.25±1.04）×101PFU/g，此時BALB/C鼠肺內(nèi)已不能分離到病毒，但可檢測到GFP-rhMPV F蛋白mRNA的表達。感染后第5天所有小鼠的心、肝、脾、腎和腦組織懸液不

8、能分離到病毒，也不能檢測到hMPVF蛋白mRNA的表達。肺組織病理改變在感染后5天明顯，為典型的間質(zhì)性肺炎改變，BALB/C小鼠組肺組織病理評分略低于SCID小鼠組，但差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：（1）GFP-rhMPV滴鼻感染后只能在肺組織中復制，在其他組織中不能復制。（2）同BALB/C小鼠相比，SCID小鼠感染GFP-rhMPV后病毒滴度高，復制時間久；但病理損傷沒有顯著性差異。
　　 PARTⅣ：糖基化位點

9、突變的人偏肺病毒感染SCID小鼠的研究
　　 目的：通過GFP-rhMPV F蛋白N-糖基化位點發(fā)生突變的幾種毒株間的比較研究，初步探討hMPV F蛋白表面的N-糖基化位點改變對病毒毒力及其致病性的影響。
　　 方法：GFP-rhMPV滴鼻感染SCID小鼠，于感染后3、5、7、9、14d處死小鼠并無菌獲取心、肝、脾、肺、腎和腦用于病毒分離和病理檢查，空班形成法檢測病毒滴度，RT-PCR和Real-time PCR法檢測G

10、FP-rhMPV mRNA表達。
　　 結(jié)果：M1、M2、M4滴鼻感染SCID小鼠后第5天肺組織分離到病毒。肺組織內(nèi)Ml病毒滴度在感染后5 d達到高峰，為（5.92±0.92）×105PFU/g，感染后14d仍能檢測到病毒，滴度可達（0.67±0.52）×102PFU/g。M2感染小鼠后第3天沒有分離到病毒，第5天才分離到病毒，滴度為（0.33±0.26）×101PFU/g，第9天時滴度為（0.58±0.58）PFU/g。M4感

11、染小鼠后第3天肺內(nèi)病毒滴度最高（0.50±0.4.5）×101PFU/g，感染后第9天肺內(nèi)已不能分離到病毒，但可檢測到GFP-rhMPV F蛋白mRNA的表達。感染GFP-rhMPV后第5天所有小鼠的心、肝、脾、腎和腦組織懸液不能分離到病毒，也不能檢測到GFP-rhMPV F蛋白mRNA的表達。肺組織病理改變在感染后5天明顯，為典型的間質(zhì)性肺炎改變。小鼠肺組織病理評分同野生型相比，M1組差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05），M2、M4組差