新生及成所小鼠對肺炎病毒感染的炎癥應答.pdf

1、目的:呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原,也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。接種疫苗是預防傳染性疾病的重要措施,接種者自然感染RSV后往往導致加重的Th2型優(yōu)勢應答和肺部炎癥性病理損傷,這是RSV疫苗成功的主要障礙。幾十年來,闡明RSV的感染機制和疫苗增強性肺部免疫病理的發(fā)病機制一直是RSV研究領域的最前沿,是研制安全有效的治療措施和RS

2、V疫苗的重要理論基礎。
　　 發(fā)病機制的研究離不開理想的實驗動物模型。小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)與人RSV(hRSV)同屬副粘病毒科、肺病毒亞科、和肺病毒屬,小鼠是PVM的天然宿主,極少量病毒即可導致嚴重感染,PVM感染小鼠可以復制RSV嚴重感染嬰幼兒的臨床特征和炎癥病理。本研究用PVM感染新生4-7天和成年6-9周的雌性BALB/c小鼠,考察PVM感染后在新生小鼠和成年小鼠模型中誘導

3、的免疫應答、炎癥反應和肺部病理變化,是發(fā)展有效的治療措施和研制安全有效的RSV疫苗的重要理論基礎。
　　 方法:
　　 1制備PVM并用BHK-21細胞滴定。
　　 2動物實驗
　　 將新生4-7天和成年6-9周BALB/c小鼠隨機分為4組,每組6只,分別為:(1)新生4-7天BALB/c小鼠感染組,(2)新生4-7天BALB/c小鼠對照組,(3)6-9周BALB/c小鼠感染組,(4)6-9周BALB/c

4、小鼠對照組。新生組用375TCID50 PVM感染,成年組用,500 TCID50 PVM感染。
　　 2.1每天稱量小鼠體重,觀察體重變化。
　　 2.2取新生感染組和新生對照組感染后1、3、5、7、9、11、14和18天的肺組織,提取總RNA,用半定量PCR擴增PVM基因SH,考察小鼠肺組織中PVM感染情況。
　　 2.3將肺沖洗液中的細胞經(jīng)瑞士.吉姆薩染色,計數(shù)各種有核細胞,觀察感染后肺部炎癥細胞的變化。<

5、br>　　 2.4留取感染后3、7、14天小鼠的肺組織做病理切片,HE染色,觀察肺組織中炎癥浸潤及組織損傷。
　　 2.5用實時定量PCR.檢測感染后1、3、5、9、14天肺組織的Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12,Th2型細胞因子IL-5、IL-6、IL-13,干擾素IFN-α、IFN-β,腫瘤壞死因子TNF-α,趨化因子MCP-1、MIP-1α、CCL5、MCP-3,黏液因子gob5,考察感染后Th1/Th2應答情況,

6、以及肺部炎癥反應情況。
　　 2.6感染后14天取血分離血清,用ELISA法測定血清IgG抗體效價。
　　 2.7成年組的檢測指標同新生組,不同的是成年組增加了感染后4h組。
　　 結果:
　　 1制備了實驗所需的PVM病毒,滴度為tCID50=107.5/ml
　　 2體重變化情況
　　 新生小鼠感染組與新生對照組相比,感染后4天體重減輕,感染后7天體重下降至最低,然后體重開始慢慢增加,

7、到14天與對照組無差異。
　　 成年感染組與成年對照組相比,感染后3天體重開始迅速下降,5天降至最低,7天開始體重慢慢增加,8天逐漸恢復正常。
　　 3半定量PCR擴增PVM基因SH
　　 新生小鼠感染PVM后1天基因SH條帶亮度比較弱,感染后5天條帶最亮,感染后7天和9天條帶亮度較弱,至18天消失。
　　 成年小鼠感染PVM4小時后基因SH條帶亮度較新生小鼠感染1天后亮,感染后3天和5天達高峰,7天、9

8、天稍微減弱,14天進一步減弱,至18天消失。
　　 4肺組織HE染色
　　 新生和成年對照組小鼠,肺泡壁結構完整,無水腫,周圍僅有少量炎性細胞;新生感染組與對照組相比,感染后3天肺間質(zhì)炎性細胞增多,肺泡壁增厚;感染后7天明顯增多,肺泡壁增厚,水腫,其中大部分為淋巴細胞,可見單核-巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞,14天炎癥減弱;成年感染組感染后3天和7天,均有大量炎性細胞浸潤,肺泡壁嚴重充血、水腫,有出血點,肺泡間隔融

9、合,14天炎癥減弱。
　　 5支氣管肺泡灌洗液中觀察炎性細胞變化情況
　　 成年小鼠感染PVM3天和7天后支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)均大于新生感染組,成年組感染后3天中性粒細胞比例是53.25％,7天組中性粒細胞比例是67.00％,而新生小鼠感染后3天中性粒細胞比例是0.00％,7天組中性粒細胞比例是27.00％,另外,成年組淋巴細胞比例也高于新生小鼠,表明成年小鼠感染PVM后比新生感染組炎性細胞浸潤程度嚴重。
　

10、　 6 ELISA法檢測小鼠感染14天后血清中特異性抗體IgG
　　 與對照組相比,新生感染組和成年感染組均產(chǎn)生了IgG抗體,且有顯著性差異(P＜0.05),成年感染組IgG抗體效價(1/400)高于新生感染組(1/200)的效價。
　　 7肺組織中細胞因子的表達情況
　　 新生小鼠感染PVM后3天肺組織的Th1型細胞因子IFN-γ顯著高于對照組(P＜0.05),之后繼續(xù)升高,9天時是對照組的150倍;感染后I

11、L-12表達量與對照組無差異(P＞0.05)。
　　 成年小鼠感染PVM后肺組織Th1型細胞因子IFN-γ和IL-12表達量均與對照組有顯著差異(P＜0.05),IFN-γ表達量感染后1天即顯著高于對照組,5天時最高,是對照組的133倍,9天開始下降。IL-12感染后5天是對照組的2倍(P＜0.05),之后與對照組無差異(P＞0.05)。
　　 新生小鼠感染后Th2型細胞因子IL-5、IL-13與對照組無差異(P＞0.0

12、5),成年小鼠感染后IL-5與對照組無差異(P＞0.05),感染后5天IL-13表達量是對照組的4倍(P＜0.05).
　　 新生小鼠感染后3天肺組織IL-6表達量達高峰(P＜0.05),是對照組的17倍,5天恢復;成年組IL-6表達量5天達高峰,是對照組的18倍。
　　 在成年和新生鼠中,IFN-α均于感染早期迅速增加,之后急速下降;IFN-β在新生鼠中的表達動力學與IFN-α一致,但在成年鼠中IFN-β在感染早期開始

13、表達,5天才達高峰。
　　 新生小鼠感染后9天腫瘤壞死因子TNF-α是對照組的30倍(P＜0.05),而成年小鼠感染后4小時TNF-α肺部表達量是對照組的76倍(P＜0.05),1天后逐漸降低,至14天和對照組無差異(P＞0.05)
　　 新生小鼠感染后趨化因子MCP-1、MCP-3、MIP-1α和CCL5均與對照組有顯著差異(P＜0.05),感染后3天肺組織MCP-1表達量是對照組的41倍,至14天低于對照組(P＜0.

14、05).感染后5天肺組織MCP-3表達量是對照組的118倍,至14天與對照組無差異(P＞0.05),MIP-1α感染后5天是對照組的21倍;感染后3天CCL5是對照組的2倍(P＜0.05);成年小鼠感染PVM后5天MCP-1是對照組的120倍(P＜0.05),至14天是仍高于對照組,MCP-3感染后5天是對照組的195倍(P＜0.05),14天仍高于對照組,MIP-1α感染后1天是對照組的50倍(P＜0.05),至14天時也仍高于對照組

15、(P＜0.05),感染后1天CCL5是對照組的5.5倍(P＜0.05)。
　　 黏液因子gob5的肺部表達量新生和成年感染組均與對照組有顯著差異(P＜0.05),新生小鼠感染后9天是對照組的6倍,而成年小鼠感染后5天是對照組的16倍,感染后9天是對照組的11倍,至14天消失,說明新生小鼠感染PVM后粘液分泌的變化。
　　 結論:
　　 PVM感染新生和成年BALB/c小鼠均可導致肺部的炎癥病理反應,成年小鼠的炎癥