流感病毒感染誘導(dǎo)成年小鼠神經(jīng)炎癥及其對情緒和學(xué)習(xí)記憶的影響.pdf

1、研究目的與意義：
　　流感病毒感染可引起人呼吸系統(tǒng)疾病，亦可感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），造成以功能障礙或組織損傷為特點的多種類型的流感相關(guān)腦病綜合征，表現(xiàn)類型多樣，包括意識喪失、學(xué)習(xí)認(rèn)知下降、行動行為改變、情緒障礙、以及免疫失調(diào)引發(fā)退行性病變和自身免疫腦病。目前發(fā)病機制尚不明確，是病毒的直接感染引起的組織損傷，還是與病毒的直接破壞作用無關(guān)，或是流感感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴或免疫失調(diào)引發(fā)疾病尚存在爭議。
　　為此，本研究探索了嗜

2、神經(jīng)性流感病毒腦定位直接感染CNS后所發(fā)生的病理變化與免疫反應(yīng)，嗜神經(jīng)性流感病毒外周（滴鼻）感染后所引起的自發(fā)行為損傷及情緒障礙變化，同時探索了嗜神經(jīng)性流感病毒與非嗜神經(jīng)性流感病毒滴鼻感染后所引起病程中的自發(fā)行為損傷、情緒障礙及空間學(xué)習(xí)記憶損傷的變化。為明確流感病毒在腦內(nèi)感染的特點，理解外周感染流感病毒對CNS功能影響提供必要的實驗依據(jù)。此外，根據(jù)流感病毒基因組核酸結(jié)構(gòu)及預(yù)實驗線索，探索重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的真核細(xì)胞與流感

3、病毒抗體的凝集反應(yīng)，為建立一種適合現(xiàn)場的流感病毒感染快速檢測方法提供研究基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1、探討病毒HA與NA基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞與病毒抗體的凝集反應(yīng)：選取流感病毒H1N1 PR8（簡稱PR8），對病毒的HA與NA基因進行克隆測序，構(gòu)建真核表達載體，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達HA與NA蛋白與制備的PR8抗體進行凝集反應(yīng)。
　　2、建立嗜神經(jīng)性病毒腦定位感染小鼠模型，探討感染后小鼠的病理變化與免疫反應(yīng)：選取流感病毒

4、H1N1 WSN33（簡稱WSN33），用腦立體定位儀感染小鼠嗅球，檢測小鼠感染后一周內(nèi)體重變化，相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化，及腦組織病理損傷的改變。
　　3、建立嗜神經(jīng)性病毒滴鼻感染小鼠模型，探討感染后小鼠兩周連續(xù)自發(fā)行為改變及情緒障礙變化：流感病毒W(wǎng)SN33感染小鼠，檢測感染后兩周內(nèi)小鼠體重變化，及兩周連續(xù)曠場自發(fā)試驗中活動總路程、平均移動速度、及糞便排泄情況變化。
　　4、建立嗜神經(jīng)性和非嗜神經(jīng)性病毒滴鼻感染小鼠模型，探

5、討感染后小鼠隨病程自發(fā)行為改變，情緒障礙及學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知損傷的變化：流感病毒W(wǎng)SN33和PR8分別感染小鼠，檢測感染后28天內(nèi)小鼠體重變化，及在前驅(qū)期、急性期、恢復(fù)初期以及完全恢復(fù)期曠場自發(fā)試驗及水迷宮試驗中活動情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功克隆獲得流感病毒PR8 HA與NA基因片段；成功構(gòu)建pcFlag-HA與pcFlag-NA真核表達質(zhì)粒；人流感病毒PR8感染BABL/c雌鼠，獲得病毒感染小鼠抗血清；pcFlag-H

6、A與pcFlag-NA（5:1）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，外源表達蛋白HA與NA與小鼠抗血清發(fā)生了凝集反應(yīng)。
　　2、成功建立嗜神經(jīng)性病毒W(wǎng)SN33腦定位感染小鼠模型；感染后第7天，小鼠腦、肺組織均不能檢測到病毒RNA；腦內(nèi)促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α無顯著變化，趨化因子CX3CL1表達下調(diào)，CXCL10表達上調(diào)；肺部促炎癥因子TNF-α表達上調(diào)；免疫熒光檢測病毒主要分布于注射嗅球部位，在感染后第3天較多，后被逐漸清除。<

7、br>　　3、成功建立嗜神經(jīng)性病毒W(wǎng)SN33外周感染小鼠模型；感染后14天內(nèi)，小鼠體重呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，第7天下降最明顯；曠場自發(fā)活動總路程縮短；平均運動速度基本不變。
　　4、成功建立嗜神經(jīng)性病毒W(wǎng)SN33和非嗜神經(jīng)性流感病毒PR8外周感染小鼠模型；感染后28天內(nèi)，兩感染組小鼠體重均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。WSN33感染組小鼠的抑郁焦慮等情緒障礙，在感染的急性期（第7天）表現(xiàn)最明顯，在恢復(fù)期（第14天）依然存在，完全恢復(fù)期

8、（第28天）基本恢復(fù)正常；PR8感染組小鼠的抑郁焦慮等情緒障礙，在感染的急性期（第7天）表現(xiàn)最明顯，在恢復(fù)期初期（第14天）和完全恢復(fù)期（第28天）仍沒有恢復(fù)。PR8感染組小鼠，對舊環(huán)境的學(xué)習(xí)能力下降主要發(fā)生在感染的恢復(fù)期（恢復(fù)初期-完全恢復(fù)期）；記憶能力下降主要發(fā)生在完全恢復(fù)期；對新環(huán)境的學(xué)習(xí)能力下降則存在于感染的整個過程。WSN33感染組小鼠，對舊環(huán)境的學(xué)習(xí)能力基本不受影響；記憶能力下降主要發(fā)生在恢復(fù)初期，在完全恢復(fù)期基本恢復(fù)；對新

9、環(huán)境的學(xué)習(xí)能力下降則存在于感染的整個過程。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了PR8 HA與NA的真核重組載體，且外源表達的蛋白與PR8感染獲得的小鼠抗血清發(fā)生了凝集，初步建立了一種適合現(xiàn)場早期檢測流感感染的血清學(xué)方法。
　　2、成功建立嗜神經(jīng)性病毒W(wǎng)SN33腦定位感染小鼠模型并引發(fā)腦及肺炎癥因子上調(diào)和免疫微環(huán)境失調(diào)，流感病毒在腦內(nèi)的感染具有范圍和效率限制性。
　　3、成功建立嗜神經(jīng)性病毒W(wǎng)SN33外周感染小鼠模型，