人來源和蝙蝠來源乙腦病毒株感染果蝠的初步實驗研究.pdf

1、目的：
　　果蝠以水果為食，體型較大，易于飼養(yǎng)，與人類和蚊子關系密切，且曾有研究表明果蝠可通過人工注射途徑而實驗感染乙腦病毒。因此，為探討人來源及蝙蝠來源乙腦病毒株對蝙蝠的感染性是否存在差異，我們選擇果蝠為實驗動物，進行了本實驗。
　　方法：
　　1.蝙蝠的捕獲與處理
　　分別于2013年6月和2014年6月，在廣東和海南省部分地區(qū)捕獲果蝠，捕獲蝙蝠的地點主要為廢日房屋和公園棕櫚樹。懷孕和哺乳期的蝙蝠放生，其余的

2、果蝠則帶回實驗室動物房飼養(yǎng)。每天喂養(yǎng)新鮮的水果（香蕉、番石榴、蘋果和梨子等）。
　　2.病毒株
　　在實驗中使用了1株人來源的乙腦病毒株(NAK)和2株蝙蝠來源的乙腦病毒株（HN2和GD1）。NAK病毒株為乙腦病毒原型株，于1935年從一個日本乙腦死亡病人腦組織中分離到，HN2病毒株于2008年分離自海南地區(qū)的長翼蝠，GD1病毒株于2009年分離自廣東地區(qū)的大足鼠耳蝠。3株乙腦病毒在注射果蝠之前均通過BHK-21細胞進行病毒

3、擴增，并分別計算其擴增后病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose，TC ID50)。
　　3.蝙蝠感染乙腦病毒
　　研究中包括了2個實驗。實驗一有8只果蝠，隨機分成3組(NAK1，HN2-1和GD1-1組)，其中NAK1組有3只果蝠（bat1，bat2和bat3），HN2-1組3只果蝠(bat4，bat5和bat6)，GD1-1組2只果蝠（bat7和bat8）。三組果蝠分別在大

4、腿根部采取皮下注射的方法注射0.1 ml NAK(104.23 BHK-21 TCID50/0.1ml)、HN2(105.24 BHK-21TCID50/0.1 ml)和GD1(105.86 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。
　　實驗二有11只果蝠，也隨機分成3組（NAK2，GD1-2和NEG組），其中NAK2組4只果蝠（bat9，bat10，bat11和bat12）、GD1-2組5只果蝠(bat13、bat14

5、、bat15、bat16和bat17)。這兩組果蝠分別皮下注射0.1 ml NAK(103.50 BHK-21TCID50/0.1 ml)和GD1(103.00 BHK-21 TCID50/0.1ml)乙腦病毒。NEG組在實驗中作為陰性對照，包括2只果蝠（bat18和bat19），大腿根部皮下注射0.1 ml不含病毒的細胞培養(yǎng)液。
　　注射乙腦病毒前后，每天觀察實驗果蝠的臨床表現(xiàn)并記錄。采用割大腿的方式分別獲取果蝠注射乙腦病毒前0

6、天以及注射乙腦病毒后4天、14天、21天的血液。所有果蝠在注射乙腦病毒后21天處死，無菌解剖觀察果蝠內(nèi)臟變化情況，并取腦組織標本，保存在含有RNAlater的凍存管中，放入-80℃保存，待檢。
　　4.蝙蝠乙腦病毒的檢測
　　單層BHK-21細胞接種所有實驗果蝠的血清樣本，細胞染毒血清后，觀察細胞病變時間≤7天。采用Roche High Pure viral RNA kit提取蝙蝠腦組織及血清病變細胞液的病毒RNA，用Roc

7、he Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用TaqMan Real time RT-PCR法檢測腦組織和血清中的乙腦病毒。
　　5.蝙蝠乙腦病毒抗體的檢測
　　采用間接ELISA和病毒中和試驗兩種方法對果蝠體內(nèi)的乙腦病毒抗體進行檢測。若ELISA IgG抗體檢測陽性，則進一步進行病毒中和試驗觀察果蝠乙腦病毒中和抗體產(chǎn)生情

8、況。間接ELISA方法是在商售JEV ELISA抗體檢測試劑盒的基礎上，進一步建立的蝙蝠JEV IgG抗體檢測方法，也就是將購白武漢科前動物生物制品有限公司的豬JEV ELISA抗體檢測試劑盒中的酶標二抗，更換為購自美國Thermo公司的Recombinant Protein A/G，Peroxidase Conjugated。病毒中和試驗則主要參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準(WS214-2008)操作步驟進行。
　　6.病理學檢

9、查
　　將實驗果蝠腦組織樣本制成病理切片，顯微鏡下觀察果蝠腦組織病理變化情況。
　　7.質(zhì)量控制
　　1)移液槍頭、凍存管、EP管等實驗耗材均為一次性用品;
　　2) RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄所用的容器和配制試劑如移液槍頭、EP管等，均事先用DEPC水處理，且仔細操作，防止環(huán)境中RNA酶的污染;
　　3)細胞培養(yǎng)的所有操作均在細胞培養(yǎng)間的超凈臺內(nèi)進行，防止污染;
　　4)果蝠的解剖在無菌間生物安全柜進行，

10、全程做好個人防護工作;
　　5)實驗過程嚴格設立陰、陽性對照及空白對照;
　　6)果蝠的血清采集和保存過程嚴防細菌污染。
　　結果：
　　1.蝙蝠臨床表現(xiàn)
　　實驗一和實驗二中的果蝠在注射乙腦病毒前后均未出現(xiàn)任何典型的乙腦臨床癥狀，身上也無任何受傷的痕跡，毛色正常。果蝠進食狀況良好，無異常表現(xiàn)。在無菌解剖時，果蝠內(nèi)臟有輕微缺血表現(xiàn)。
　　2.蝙蝠病毒血癥檢測結果
　　所有的果蝠血清樣本均通過BH

11、K-21細胞進行了病毒增值。在實驗一中，細胞可見到明顯的病變效應（cytopathic effect，CPE），主要有細胞變圓、細胞間隙增寬以及細胞脫落等。實驗一中的大多血清樣本(7/13)通過TaqMan Real timeRT-PCR檢測乙腦病毒陽性，且三個注射組間檢出率相似。實驗二中的所有果蝠均未檢測到病毒血癥。
　　3.蝙蝠腦組織乙腦病毒檢測結果
　　利用TaqMan Real time RT-PCR法對實驗一和實驗

12、二中果蝠腦組織標本進行乙腦病毒檢測，結果實驗一f中所有果蝠腦組織標本（除了HN2-1組的bat5）均乙腦病毒檢測陽性，而實驗二中所有果蝠腦組織標本均為陰性。
　　4.蝙蝠ELISA檢測結果
　　實驗一和實驗二的所有注射病毒的果蝠血清均檢測到了抗乙腦病毒IgG抗體，提示果蝠對來自人型和蝙蝠型的乙腦病毒株都可產(chǎn)生免疫反應。實驗一的果蝠在感染乙腦病毒第4天時乙腦病毒IgG抗體陰性，后全部轉(zhuǎn)為陽性;實驗一和實驗二的果蝠均在感染乙腦病

13、毒第14～21天左右產(chǎn)生乙腦病毒抗體高峰。
　　5.蝙蝠乙腦病毒中和抗體檢測結果
　　對所有感染乙腦病毒的實驗果蝠的21天血液進行病毒中和試驗，結果15個ELISA檢測陽性的標本中有14個病毒中和試驗陽性（陽性率93.3％），只有GD1-2組的bat14為陰性。實驗一的中和抗體滴度均高于實驗二的中和抗體滴度(1∶23.41～1∶56.30vs.1∶5.00～1∶15.87，t=-5.733,P＜0.001)。
　　6.

14、蝙蝠腦組織病理檢查結果
　　實驗二中NAK2和GD1-2組的果蝠腦組織均大體結構正常，但可見輕微的炎癥反應，包括輕度的血管充血、水腫、淋巴細胞侵潤等。實驗一果蝠腦組織未進行病理學檢查。
　　結論：
　　1、果蝠對人來源(NAK)及蝙蝠來源（HN2和GD1）的乙腦病毒株均易感，且均為無癥狀感染，提示乙腦病毒已經(jīng)適應果蝠。
　　2、人來源(NAK)和蝙蝠來源（HN2和GD1）乙腦病毒株對果蝠的感染力、毒力相似，且果蝠