四株不同動物來源弓形蟲感染小鼠和雞免疫病理變化的比較研究.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，在世界上分布廣泛，大約有25％-50％的人受到感染。弓形蟲的宿主非常廣泛，貓科動物是其唯一的終末宿主，絕大多數(shù)溫血動物均可作為該病原的中間宿主，然而不同宿主對弓形蟲的易感性及轉歸均有不同。小鼠對其極為敏感，可引起急性的致死性感染因而常常作為弓形蟲急性感染的動物模型;而雞由于對弓形蟲的感染不表現(xiàn)任何臨床癥狀，被認

2、為是不敏感的中間宿主。為了探尋這兩種動物感染弓形蟲后免疫病理學變化的差異，同時針對同一宿主對不同動物來源的弓形蟲蟲株感染后的免疫病理變化進行比較研究，特進行了如下工作:
　　 1.貓源弓形蟲蟲株的分離及其與雞源、豬源和人源蟲株基因型的鑒定
　　 對江蘇南京地區(qū)11只家貓進行弓形蟲抗體IgG的檢測，篩選抗體陽性貓進行蟲株的分離。利用鹽酸-胃蛋白酶消化法處理陽性貓的心、腦、舌等組織，制成組織懸液腹腔接種小鼠，通過連續(xù)傳代，分

3、離到2株弓形蟲蟲株，分別命名為CAT2和CAT3。進而利用PCR-RFLP方法，對分離到的貓源蟲株以及實驗室保存的雞源(JS)、豬源(CN)和人源(RH)共5株弓形蟲蟲株進行了基因型的鑒定，通過對7個等位基因5'-SAG2，3'-SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，cB21-4和L358的擴增和酶切，證明此5株弓形蟲蟲株均為基因Ⅰ型。
　　 2.四種不同來源弓形蟲蟲株對小鼠和雞致病力的比較
　　 小鼠對弓形蟲非常敏感

4、，而雞通常不敏感。本研究對四種不同來源的5個蟲株RH，CN，JS，CAT2和CAT3對雞和小鼠的致病力分別進行比較，同時建立弓形蟲感染雛雞的動物模型。210只10日齡雛雞分為21個組，每組10只，5個蟲株RH，CN，JS，CAT2和CAT3按照5×108，1×108，1×107，和1×106不同劑量腹腔感染10日齡雛雞，同時設陰性對照組，僅注射生理鹽水;感染后每日觀察實驗雞的臨床癥狀，逐只測量直腸溫度，記錄每組雞的死亡情況;利用PCR方

5、法對53天未死亡的雞進行檢測，對急性死亡和53天未死亡的雞進行病理組織切片，觀察病理變化。對小鼠致病力的對比試驗選用腹腔感染和灌胃感染兩種途徑，分別選用260只ICR小鼠，隨機分為26個組，每組10只，按照不同的蟲株選擇1×105，1×104，1×103，1×102和1×101劑量進行感染，記錄每只小鼠的存活時間;根據(jù)實驗動物的存活時間對5個蟲株的致病力進行比較。結果發(fā)現(xiàn)RH，CN，CAT2和CAT3四個蟲株對小鼠和雞的致病力無顯著差異

6、，而JS株對小鼠的致病力較弱，但對雞的致病力較強，這說明蟲株的來源對弓形蟲的致病性具有重要的影響。同時發(fā)現(xiàn)1×107劑量的速殖子腹腔感染10日齡雛雞，既能產(chǎn)生適度的臨床癥狀，又能夠使實驗動物避免死亡，可作為弓形蟲體內(nèi)感染雛雞的動物模型。綜合考慮小鼠的感染率、存活時間以及感染過程中的偶然因素，發(fā)現(xiàn)1×102腹腔感染和1×104灌胃感染是小鼠模型的最佳感染劑量。
　　 3.四種不同來源弓形蟲蟲株腹腔感染小鼠免疫病理變化的比較

7、　　 本實驗將JS、CAT、CN和RH弓形蟲蟲株腹腔感染小鼠，對小鼠感染弓形蟲后的免疫病理變化進行比較。200只小鼠(18-22g)隨機分成5個組，每組40只，分別命名為JS，CAT, CN，RH和陰性對照組，四個蟲株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×102的劑量腹腔感染小鼠，陰性對照組僅注射PBS。感染后分別在第0天，3天，6天和8天采血和脾臟用于分離血清和脾臟淋巴細胞，每組10只。弓形蟲循環(huán)抗原和特異性抗體（IgA，IgG、I

8、gM和IgG的亞型IgG1、IgG2a、IgG2b扣IgG3）利用ELISA方法進行檢測;脾臟淋巴細胞中CD4+、CD8+T細胞和NK細胞以及MHCⅠ和MHCⅡ類分子的變化利用流式技術進行檢測;細胞因子IFN-γ，IL-12，IL-4，IL-10和IL-17利用ELISA方法進行檢測;血清鐵、血清中NO和iNOS的活性利用比色法進行檢測。感染后第6天能夠檢測到IgM并持續(xù)至第8天;感染后第8天能檢測到IgA，而IgG及其亞型均未檢測到;

9、CD4+、CD8+T和NK細胞分別在第6天、第3天和第3天顯著上升，均在第8天時顯著下降，在此時間點僅CN組CD4+T細胞顯著高于陰性對照組，4個感染組CD8+T細胞雖下降但仍顯著高于陰性對照組，RH、CN和CAT組NK細胞顯著高于陰性對照組;MHCⅠ分子第6天顯著上升但在第8天時下降，僅CAT組顯著高于陰性對照組;MHCⅡ分子從第3天顯著下降并持續(xù)至第8天仍顯著低于陰性對照組;IFN-γ和IL-12在第6天顯著上升均在第8天時下降，4

10、個感染組IFN-γ在第8天仍顯著高于陰性對照組，但JS組IL-12與陰性對照組無差異;IL-10和IL-4在第3天顯著上升均在第6天時顯著下降，4個感染組IL-10仍顯著高于陰性對照組，但IL-4與陰性對照組無差異;IL-17在第6天顯著上升并持續(xù)至第8天仍高于陰性對照組;感染后第3天可檢測到高濃度的NO、血清鐵以及高活力的iNOS，均在第6天達到最高峰而后下降，第8天時，僅CAT組NO顯著高于陰性對照組，4個感染組的iNOS與陰性對照

11、組之間差異不顯著，但血清鐵仍顯著高于陰性對照組。這些結果反應了小鼠抗弓形蟲腹腔感染而引起的免疫病理學變化，而不同來源蟲株之間存在的差異可能與蟲株的生物學特性有關，說明蟲株的來源對弓形蟲免疫病理變化也具有重要的影響。
　　 4.四種不同來源弓形蟲蟲株灌胃感染小鼠免疫病理變化的比較
　　 本實驗將JS、CAT、CN和RH弓形蟲蟲株灌胃感染小鼠，對小鼠感染弓形蟲后的免疫病理變化進行比較。250只小鼠(18-22g)隨機分成5個

12、組，每組50只，分別命名為JS，CAT, CN，RH和陰性對照組，四個蟲株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×104的劑量灌胃感染小鼠，陰性對照組僅灌服等量PBS。感染后分別在第0天，3天，6天，8天和10天采血和脾臟用于分離血清和脾臟淋巴細胞，每組10只。弓形蟲循環(huán)抗原和特異性抗體（IgA，IgG、IgM和IgG的亞型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）利用ELISA方法進行檢測;脾臟淋巴細胞中CD4+、CD8+T細胞和NK

13、細胞以及MHCⅠ和MHCⅡ類分子的變化利用流式技術進行檢測;細胞因子IFN-γ，IL-12，IL-4，IL-10和IL-17利用ELISA方法進行檢測;血清鐵、血清中NO和iNOS的活性利用比色法進行檢測。感染后第6天TCA陽性并持續(xù)至第10天;第10天時IgG顯著上升并以IgG2a和IgG2b為主;IgA和IgM第6天時顯著上升并持續(xù)至第10天;CD4+和CD8+T細胞第6天時開始顯著上升，第8天達到高峰，各組CD4+T細胞在第10天

14、下降，與陰性對照組無差異，而CD8+T細胞雖下降，但CN、CAT和JS仍顯著高于陰性對照組;弓形蟲感染后第3天，JS和CAT組NK細胞水平顯著上升，第8天時，四個感染組均上升并持續(xù)至第10天;CAT組MHCⅠ水平第3天顯著上升，其余三個感染組無顯著變化，第8天，四個感染組均顯著上升，第10天時開始下降，但除JS組外，其余三個感染組仍顯著高于陰性對照組;MHCⅡ分子在第3天顯著下降并持續(xù)至第10天;感染后第6天，JS和CAT感染組組IFN

15、-γ顯著上升，第8天時，RH、CN和JS三個組顯著上升，但CAT組下降，第10天時4個感染組均下降與陰性對照組無差異;RH和CAT組IL-12在感染后第3天顯著上升，第6天時四個感染組均顯著上升并持續(xù)至第8天，第10天時開始下降僅CAT組顯著高于陰性對照組;RH和CAT組IL-4僅在第6天時顯著上升;CN、JS和CAT組IL-17在第8天時顯著上升而后開始下降，第10天時僅JS組顯著高于陰性對照組;NO、血清鐵和iNOS的活力均在第3天

16、開始顯著上升并持續(xù)至第8天，第10天時下降與陰性對照組之間無差異。這些結果反應了小鼠弓形蟲灌胃感染所引起的免疫病理變化。與腹腔感染小鼠相比，較晚出現(xiàn)的TCA，較早出現(xiàn)并且較高滴度的IgA以及產(chǎn)生的IgG說明腹腔感染和灌胃感染兩種不同的感染途徑影響免疫病理變化的產(chǎn)生。
　　 5.四種不同來源弓形蟲蟲株腹腔感染雞免疫病理變化的比較
　　 本實驗將JS、CAT、CN和RH弓形蟲蟲株腹腔感染雛雞，對雞感染弓形蟲后的免疫病理變化進

17、行比較。300只10日齡雛雞隨機分成5個組，每組60只，分別命名為JS，CAT, CN，RH和陰性對照組，JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×107的劑量腹腔感染雛雞，陰性對照組僅注射PBS。感染后分別在第0天，4天，11天，25天，39天和53天采血和脾臟，分離血清和脾臟淋巴細胞，每組取10只。弓形蟲循環(huán)抗原和特異性的抗體（IgA，IgG和IgM）利用ELISA方法進行檢測;脾臟淋巴細胞中CD4+，CD8+以及MHCⅠ和MHCⅡ類分

18、子的變化利用流式技術進行檢測;細胞因子IFN-丫，IL-12，IL-4，IL-10和IL-17利用ELISA方法進行檢測;血清鐵、血清中NO和iNOS的活性利用比色法進行檢測;血細胞包括中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞利用血細胞分析儀直接測定。感染組高水平的IgM，IgG和IgA分別在感染后第4天，第11天和第11天出現(xiàn)，并持續(xù)至39、53和39天;不同感染組CD4+T細胞分別在第4天和第11天顯著上升，至53天時與陰性對照組無顯著差異;

19、CD8+T細胞和MHCⅠ類分子在第4天顯著上升，至53天時，CD8+T細胞仍顯著高于陰性對照組，而MHCⅠ類分子在39天時與陰性對照組差異不顯著;MHCⅡ類分子在第4天顯著上升又在25天時顯著下降，至53天時與陰性對照組差異不顯著;IFN-γ，IL-12，IL-10和IL-17分別在感染后第4天顯著上升，25天時，感染組IFN-γ和IL-10與陰性對照組差異不顯著，而感染組IL-12至53天時仍顯著高于陰性對照組，IL-17則無顯著差異

20、;4個感染組IL-4自始至終均無顯著變化;感染組NO，血清鐵以及iNOS的活力在第4天顯著上升，又在第39天后與陰性對照組無顯著差異。這些都反應了雞感染弓形蟲后的免疫病理學變化。與另外三個感染組相比，JS組具有更高水平的CD4+，CD8+T細胞，IFN-γ，IL-12，IL-10，NO和更高活力的iNOS，這說明其差異可能與蟲株的來源有關。與腹腔感染小鼠的結果相比，IgG抗體的產(chǎn)生，感染早期顯著上升的MHCⅡ，較早產(chǎn)生的IFN-γ、IL