弓形蟲CK1α缺失株感染小鼠毒力試驗及機制研究.pdf

1、弓形蟲，為頂復動物門寄生原蟲，可感染人類和幾乎其他所有的溫血動物，常引起孕婦妊娠階段流產(chǎn)，胎兒畸形、先天性缺陷或死胎等嚴重后果，免疫能力低下人群感染嚴重疾病。近幾年研究表明，弓形蟲還會影響宿主的一些行為舉止，甚至與多種精神疾病有關(guān)。據(jù)國外報道，人感染弓形蟲的平均感染率為25％~50%。而我國的人群感染率在0.1%~47.3%，豬感染率為4.78%~85.7%，牛的感染率為0.2%~43.4%。可見弓形蟲病已經(jīng)嚴重影響了人類的健康生活和畜

2、牧業(yè)的發(fā)展。
　　蛋白激酶（Protein Kinase，PK）在弓形蟲增殖、分化和感染過程中起著至關(guān)重要的作用。以往研究表明，鈣依賴蛋白激酶Ⅰ（CDPK1）在弓形蟲胞吐中起著重要的調(diào)節(jié)作用；絲裂原活化蛋白激酶Ⅰ（MAPK1）通過誘導一氧化氮復合物（iNOS）合成抑制干擾素（IFN）合成，調(diào)節(jié)弓形蟲的增殖；棒狀體蛋白激酶是一種弓形蟲特有的蛋白激酶，參與調(diào)控弓形蟲對宿主免疫反應的影響。酪蛋白激酶（CK）是真核生物的一種保守的絲/蘇氨

3、酸蛋白激酶，由Bnrnet在1954年在大鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)的，其功能是催化肽鏈中鄰近酸性氨基酸殘基的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。該蛋白激酶由Ⅰ型酪蛋白激酶（Casein Kinase1，CK1）和Ⅱ型酪蛋白激酶（Casein Kinase2，CK2）兩大家族蛋白組成。CK1參與調(diào)節(jié)多種重要的細胞過程，包括wnt信號通路、膜運輸、細胞骨架的維護等。最近研究發(fā)現(xiàn)多種原核生物有CK1基因表達，如弓形蟲、瘧原蟲、利氏曼原蟲、錐蟲等。此外， CK1抑制劑

4、還可以抑制鞭毛蟲和錐蟲在血液中的增殖。
　　CK1在機體多種生理活動中發(fā)揮著舉足輕重的作用，如細胞分裂與凋亡、DNA修復、P53調(diào)控、周期性節(jié)律等。弓形蟲基因組可以編碼CK1α和CK1β兩種CK1亞型，其中只有CK1α具有酶活性。CK1α是一種非第二信使依賴的激酶，以ATP作為單一磷酸供體，分布于細胞的細胞膜、細胞質(zhì)以及細胞核中。在哺乳動物中，CK1α參與多種細胞生理活動，如細胞周期、染色體分離、膜轉(zhuǎn)運、細胞分化和細胞凋亡等。此外

5、，CK1α參與Wnt/β-Cat、Hedgehog（Hh）及NF-κB等信號通路。弓形蟲作為一種重要的模式生物和人獸共患病原， CK1α基因在其感染宿主過程中的作用還不清楚。
　　研究目的：
　　利用實驗室已有的CK1α克隆缺失株（△ck1α）感染BALB/c小鼠，通過與野生株GT1對比，確定CK1α對弓形蟲感染宿主毒力的影響。利用熒光定量PCR、ELISA、轉(zhuǎn)錄組測序和Western blot等方法，推論出CK1α調(diào)節(jié)弓形

6、蟲毒力的具體機制。為預防弓形蟲感染，研制疫苗和治療藥物提供一定的依據(jù)。
　　研究內(nèi)容：
　　1、通過小鼠攻蟲試驗，確定CK1α缺失對弓形蟲毒力的影響；
　　2、研究CK1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機制。
　　研究方法：
　　1、確定CK1α對弓形蟲毒力的影響
　　90只6~8周齡BALB/c雌性小鼠，采用隨機分組的方法分為9組，每組十只小鼠，每只小鼠腹腔接種200μL弓形蟲速殖子稀釋液。第一組：每只小鼠接

7、種102個GT1速殖子；第二組：每只小鼠接種103個GT1速殖子；第三組：每只小鼠接種104個GT1速殖子；第四組：每只小鼠接種102個△ck1α速殖子；第五組：每只小鼠接種103個△ck1α速殖子；第六組：每只小鼠接種104個△ck1α速殖子；第七組：每只小鼠接種102個CK1α回補株速殖子；第八組：每只小鼠接種103個CK1α回補株速殖子；第九組：每只小鼠接種104個CK1α回補株速殖子；根據(jù)小鼠死亡時間繪制生存曲線，分析CK1α缺

8、失對于宿主生存時間的影響。在感染第3天和第7天處死感染小鼠，觀察小鼠肝組織損傷狀況， ELISA檢測天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine Transaminase，ALT）含量，定量PCR(RT-PCR)檢測肝臟組織和脾臟組織荷蟲量，流式細胞術(shù)檢測血清中IL-12、IFN-γ等細胞因子含量，分析CK1α缺失對弓形蟲毒力的影響。
　　2、確定CK1α調(diào)節(jié)弓形

9、蟲毒力的機制
　　取感染3天和7天小鼠的肝臟組織和脾臟組織， Western blot檢測肝臟組織和脾臟組織中MAPK信號通路、NF-κB信號通路和STAT信號通路活化情況，熒光定量PCR（RT-PCR）檢測肝臟組織和脾臟組織中IL-12、IFN-γ等細胞因子含量，轉(zhuǎn)錄組測序檢測棒狀體蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化。確定CK1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機制。
　　研究結(jié)果：
　　1、CK1α缺失后，小鼠生存時間減短。
　　第三組小

10、鼠在腹腔注射5天后出現(xiàn)明顯的體外特征，在注射7-9天內(nèi)死亡，平均存活時間（MST）為7.7天。第一組和第二組小鼠在注射后10-13天死亡， MST分別為11.4天和10.4天。第六組小鼠在腹腔注射后4天出現(xiàn)明顯癥狀，在注射6-8天死亡，MST為6.8天。第四組和第五組在注射后8-12天死亡，MST分別為10.5天和8.4天。注射回補株組MST與等量注射GT1速殖子組MST無明顯差異（P＞0.05）。
　　2、CK1α缺失后，弓形蟲

11、毒力增加。
　　△ck1α感染小鼠，肝組織較GT1野生株出現(xiàn)明顯的病理性損傷；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量相較于GT1感染小鼠均提高了4~6倍，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量提高了2~4倍；肝脾組織荷蟲量均明顯高于GT1感染小鼠；△ck1α感染小鼠血清中IL-12和IFN-γ分泌量低于GT1感染小鼠。
　　3、△ck1α通過ROP16活化STAT3抑制IL-12分泌，增加弓形蟲毒力。
　　△ck1α感染小鼠，肝脾組織

12、中 MAPK信號通路蛋白和NF-κB信號通路蛋白基本無明顯差異，只有肝組織內(nèi)MAPK p38磷酸化程度增加，這可能是導致肝組織嚴重損傷的原因。肝脾組織中STAT1/4蛋白磷酸化程度均低于GT1感染小鼠，STAT3/6明顯高于GT1，轉(zhuǎn)錄組測序檢測發(fā)現(xiàn)ROP16蛋白分泌量△ck1α感染小鼠明顯高于GT1。
　　研究結(jié)論：
　　1、△ck1α感染小鼠生存時間明顯減短， CK1α缺失后，弓形蟲毒力顯著增強；
　　2、△ck1