酪蛋白激酶CK1α調(diào)控弓形蟲增殖的初步研究.pdf

1、弓形蟲是一種機會性致病原蟲，可引起人獸共患的弓形蟲病。該病呈世界范圍分布，孕婦感染弓形蟲導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒發(fā)育遲緩、畸形或死胎。艾滋病、腫瘤患者等免疫力低下人群感染后可導(dǎo)致心肌炎、肺炎或致死性腦炎。弓形蟲感染對畜牧業(yè)危害極為嚴(yán)重，家畜感染后生產(chǎn)性能大幅下降，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前無較好藥物和疫苗可在實際生產(chǎn)生活中應(yīng)用，因此制備有效的疫苗和尋找藥物治療靶點成為當(dāng)前研究熱點。
　　酪蛋白激酶(casen kinase，CK)是一類保守的絲

2、/蘇氨酸蛋白激酶，可磷酸化機體多種重要蛋白。該激酶分為兩大家族:一類為Ⅰ型酪蛋白激酶(caein kinase1，CK1)，一類為Ⅱ型酪蛋白激酶(casein kinase2，CK2)。CK1在脊椎動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)七種異構(gòu)體，分別為CK1α，CK1β，CK1γ1，CK1γ2，CK1γ3，CK1δ和CK1ε,有的異構(gòu)體還存在不同形式的剪接體。CK1在細(xì)胞分裂與凋亡、DNA修復(fù)、P53調(diào)控、周期性節(jié)律等機體多種生理活動中起著至關(guān)重要的作用。<

3、br>　　CK1α參與DNA修復(fù)、核轉(zhuǎn)運、染色體分離及有絲分裂紡錘體形成等細(xì)胞生理活動的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)Wnt、Hedgehog、 TNFα等信號通路中具有重要作用，同時該激酶還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。弓形蟲作為一種重要的模式生物和人獸共患病原，CK1α功能還不清楚。為探索弓形蟲CK1α功能，本研究克隆弓形蟲CK1α cDNA，構(gòu)建弓形蟲CK1α原核表達(dá)載體，表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠，制備弓形蟲CK1α小鼠多克隆抗體，運用IFA方法檢測CK1α

4、蛋白在弓形蟲體內(nèi)表達(dá)部位;以腐草霉素抗性基因(ble)為篩選標(biāo)記，構(gòu)建弓形蟲CK1α基因打靶載體，通過抗性篩選及相關(guān)鑒定，獲得弓形蟲CK1α缺失蟲株;應(yīng)用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及小鼠毒力試驗等，確定弓形蟲CK1α功能，為鑒定弓形蟲病藥物治療靶點奠定基礎(chǔ)。
　　(1)弓形蟲CK1α克隆及序列分析通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增CK1α編碼序列，大小975 bp。序列分析表明，弓形蟲與其他寄生原蟲CK1α高度同源，與新孢子蟲同源性最高(98％)

5、，與隱孢子蟲、艾美爾球蟲同源性為92％，與巴貝斯蟲、瘧原蟲同源性分別為82％和78％，與利什曼原蟲、錐蟲同源性最低（69％和68％）。哺乳動物間CK1α同源性高達(dá)90％以上，弓形蟲與哺乳動物CK1α比同源性偏低，在58％-70％之間。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示弓形蟲與哺乳動物CK1α親緣關(guān)系遠(yuǎn)，從序列水平分析CK1α具備作為弓形蟲病藥物治療靶位點的條件。
　　(2)弓形蟲CK1α原核表達(dá)透過RT-PCR技術(shù)克隆弓形蟲CK1αcDNA，構(gòu)建

6、原核表達(dá)載體pET-28a-TgCK1α，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析，重組CK1α分子量為38 kDa。經(jīng)Ni-NTA純化，重組CK1α濃度達(dá)3.1 mg/mL，純度達(dá)90％以上。將重組蛋白CK1α免疫小鼠，制備多克隆抗體，抗體ELISA效價達(dá)1∶6400，運用IFA檢測CK1α在弓形蟲體內(nèi)表達(dá)部位，結(jié)果證實CK1α主要在弓形蟲細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，靠近細(xì)胞核稍多。
　　(3)弓形蟲

7、CK1α缺失株構(gòu)建利用PCR方法克隆弓形蟲CK1α側(cè)翼序列，以ble為篩選標(biāo)記，構(gòu)建基因打靶載體，線性化后電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲，腐草霉素篩選，獲得抗性蟲株。通過同源重組鑒定引物運用PCR鑒定，初步篩選弓形蟲CK1α缺失株。分別以CK1α、ble基因為探針對弓形蟲CK1α缺失株做Southern blotting鑒定，利用CK1α多克隆抗體經(jīng)Westernblotting進(jìn)一步鑒定，獲得弓形蟲CK1α缺失株。
　　(4)弓形蟲CK1α功

8、能初步研究通過黏附、侵入、增殖、毒力試驗鑒定CK1α缺失對弓形蟲生物學(xué)特性的影響。結(jié)果表明，CK1α缺失株增殖速度較野生株慢(P＜0.05)，證明CK1α的表達(dá)影響弓形蟲增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期差異，結(jié)果CK1α缺失株S期高于野生株，經(jīng)統(tǒng)計分析差異顯著(P＜0.05)，說明CK1α缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在S期影響蟲體增殖，CK1α是弓形蟲增殖的調(diào)控基因。黏附、侵入與毒力試驗表明，CK1α缺失株的黏附、侵入能力及致病力與野生株差異不顯著

9、(P＞0.05)。
　　本研究得出以下結(jié)論:
　　(1)獲得弓形蟲CK1α基因并分析其進(jìn)化特征，蛋白序列比對弓形蟲與哺乳動物CK1α同源性低，在58％-70％之間。進(jìn)化樹分析弓形蟲與哺乳動物CK1α親緣關(guān)系遠(yuǎn)，CK1α具備作為弓形蟲病藥物治療靶位點的條件。
　　(2)獲得弓形蟲CK1α重組蛋白，分子量38kDa，通過定位其主要在弓形蟲細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，靠近細(xì)胞核稍多。(3)獲得弓形蟲CK1α缺失株，通過反向遺傳學(xué)研究CK1