家蠅幼蟲抗菌肽抗弓形蟲作用的初步研究.pdf

1、目的： 1．采用研磨、高速離心、AKTA puritier層析系統(tǒng)從家蠅幼蟲血淋巴中分離純化出有抗弓形蟲作用的抗菌肽。 2．采用MTT比色法和瑞姬氏染色法觀察所提取抗菌肽的抗弓形蟲作用，并觀察抗菌肽對宿主細(xì)胞的毒性作用。 3．采用MTT比色法比較不同溫度和酸堿度下抗菌肽的穩(wěn)定性。 4．采用掃描電鏡和流式細(xì)胞技術(shù)對抗菌肽抗弓形蟲的作用機制進(jìn)行初步探討。 方法： 1．通過針刺感染誘導(dǎo)三齡家蠅幼

2、蟲大量產(chǎn)生抗菌肽，提取其血淋巴，依次經(jīng)ResourceS陽離子柱和Superdex G75凝膠柱層析進(jìn)行純化，MTT法進(jìn)行抗弓形蟲活性篩選，Tricine-SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。 2．將篩選出的抗菌肽用PBS調(diào)整濃度為12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml分別作用于體外游離的和Vero細(xì)胞內(nèi)的弓形蟲速殖子，采用MTT法和瑞姬氏染色法觀察其24h、48h和72h的抑制率，并采用MTT法觀察其對宿主細(xì)胞的毒性作用。

3、 3．將50μg/ml的家蠅幼蟲抗菌肽分別經(jīng)過不同的溫度(20℃、40℃、60℃、80℃、100℃)處理60min及100℃處理1min，5min，15min，30min，60min和不同的pH值(2、4、6、8、10)處理60min后，MTT比色法觀察所篩選抗菌肽的穩(wěn)定性。 4．將50μg/ml的家蠅幼蟲抗菌肽作用于體外游離的弓形蟲速殖子24h后，采用透射電鏡觀察弓形蟲速殖子超微結(jié)構(gòu)的變化，并采用流式細(xì)胞技術(shù)測定其對弓形

4、蟲速殖子DNA的損傷作用。 結(jié)果： 1．經(jīng)Resource s陽離子柱層析后，分別在保留體積為14ml和16ml處出現(xiàn)兩個峰，經(jīng)MTT比色法檢測發(fā)現(xiàn)16ml處出現(xiàn)的峰物質(zhì)有抗弓形蟲活性；將此峰物質(zhì)再經(jīng)過SuperdexG75凝膠柱層析出現(xiàn)6個峰，經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)在保留體積分別為19ml和25ml處收集的峰物質(zhì)有抗弓形蟲活性，后者活性較強。將保留體積為25ml處收集的峰進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE，電泳圖譜證實為

5、單一的蛋白質(zhì)條帶，分子量約為5.0ku。將其暫命名為AMP-1。 2．研究發(fā)現(xiàn)，AMP-1的抗游離弓形蟲作用隨著濃度的增大和時間的延長而升高(P＜0.05)。瑞姬氏染色結(jié)果顯示，各時間點抗菌肽組弓形蟲速殖子對Vero細(xì)胞的損傷程度均較對照組輕。由于72h組對照組和12.5μg/m組Vero細(xì)胞被嚴(yán)重破壞，因此只分析了24h和48h各組弓形蟲對Vero細(xì)胞的侵入情況。24h和48h各濃度抗菌肽組對弓形蟲的侵入率均隨著濃度的增大而減

6、小(P＜0.05)。AMP-1濃度由小到大作用于Vero細(xì)胞72h后，細(xì)胞存活率分別為94.04％，90.70％和81.94％，50μg/ml組Vero細(xì)胞的吸光度值與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 3．AMP-1經(jīng)過不同溫度處理60min后，對弓形蟲的抑制作用隨著溫度升高呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，加熱至100℃時AMP-1已失去活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AMP-1經(jīng)100℃加熱超過5min后，其活

7、性迅速下降，15min時活性完全喪失。 AMP-1經(jīng)不同pH環(huán)境處理后，對弓形蟲的抑制作用呈先升高后降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)pH為4，6和8時，AMP-1抗弓形蟲活性良好，pH為2和10時，AMP-1喪失活性。 4．透射電鏡觀察到，對照組弓形蟲速殖子縱切面呈香蕉形或半月形，蟲體細(xì)胞膜由內(nèi)、外兩層構(gòu)成，膜光滑連續(xù)，核呈圓形或橢圓形，核膜清晰可見，染色質(zhì)呈小塊狀散布于核質(zhì)中，核周可見線粒體等細(xì)胞器，線

8、粒體內(nèi)有眾多的嵴，呈管狀或囊狀。AMP-1作用后部分弓形蟲速殖子被破壞，形態(tài)變圓或橢圓形，細(xì)胞膜突出，破裂；細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，呈均質(zhì)化，線粒體腫脹，嵴排列紊亂，部分缺失，致密顆粒減少，有的胞質(zhì)中出現(xiàn)許多空泡；細(xì)胞核增大，核周隙明顯增寬，染色質(zhì)凝集。 從流式細(xì)胞技術(shù)測定得到的DNA含量直方圖顯示：AMP-1組的速殖子數(shù)少于對照組，且兩組分布參數(shù)存在較明顯差異，表現(xiàn)為對照組中弓形蟲速殖子處于M1期的較M2期的少，AMP-1組則相反，處

9、于M1期的較M2期的多，且M1峰值明顯前移(P＜0.05)。 結(jié)論： 1．家蠅幼蟲血淋巴中存在有抗弓形蟲作用的抗菌肽(AMP-1)，分子量約為5ku。 2．AMP-1能有效抑制游離的和與Vero細(xì)胞共培養(yǎng)的弓形蟲速殖子，并且對正常宿主Vero細(xì)胞損傷較小。 3．AMP-1在20-80℃及pH4-8條件下穩(wěn)定性較好。 4．AMP-1不僅能引起弓形蟲速殖子細(xì)胞膜受損，而且對胞內(nèi)細(xì)胞器，細(xì)胞核及核內(nèi)DN