調(diào)控宿主細(xì)胞自噬對弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的影響.pdf

1、目的:檢測弓形蟲感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的程度,研究細(xì)胞自噬在弓形蟲增殖復(fù)制中的作用。
　　方法:對使用自噬抑制劑、誘導(dǎo)劑作用后不同時間點的弓形蟲感染復(fù)制動力學(xué)檢測以及形態(tài)檢測,判斷自噬在弓形蟲增殖復(fù)制過程中的作用。昆明小鼠(雌鼠,5-7周齡,體重16-20g)用于RH株(弓形蟲強毒株)的保種和實驗。將RH株腹腔注射感染小鼠平均4-5天發(fā)病無菌抽取腹水純化弓形蟲計數(shù)后感染HEF細(xì)胞用于實驗。實驗分組如下:①正常對照組(HEF細(xì)胞)②R

2、H株+HEF細(xì)胞③自噬抑制劑+RH株+HEF細(xì)胞④自噬誘導(dǎo)劑+RH株+HEF細(xì)胞。分別用自噬抑制劑Bafilomycin A1及自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰作用于HEF細(xì)胞,然后將弓形蟲(RH株)速殖子懸液分別以蟲/細(xì)胞2:1、4:1、8:1、16:1感染HEF細(xì)胞,作用1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h。將計數(shù)后的HEF細(xì)胞于六孔板中培養(yǎng)待細(xì)胞爬片貼壁后分別進行Giemsa染色和吖啶橙熒光染色,于24孔板中進行MDC(Monodans

3、ylcadaverin)熒光染色。采用吖啶橙熒光染色和MDC熒光染色檢測HEF細(xì)胞自噬情況,采用Giemsa染色檢測不同時間點的弓形蟲感染復(fù)制動力學(xué)。通過建立弓形蟲感染的小鼠模型,分別使用自噬抑制劑巴弗洛霉A1(bafilomycin A1)和自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰對弓形蟲感染小鼠模型進行了干預(yù),應(yīng)用熒光定量PCR檢測不同實驗條件下弓形蟲的增殖情況。
　　結(jié)果:弓形蟲增殖觀察:Giemsa染色觀察弓形蟲速殖子在細(xì)胞內(nèi)的寄生:隨機鏡檢10

4、0個細(xì)胞,檢測不同時間蟲體的侵襲率和胞內(nèi)平均增殖數(shù),侵襲率=侵襲的細(xì)胞數(shù)/100×100％、胞內(nèi)平均增殖數(shù)=各細(xì)胞內(nèi)蟲體數(shù)量總和/被侵襲的細(xì)胞數(shù)×100%。吖啶橙和MDC熒光染色用以觀察判斷細(xì)胞自噬過程的發(fā)生情況。吖啶橙和MDC熒光染色結(jié)果表明自噬抑制劑Bafilomycin A1及自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰可分別抑制和促進HEF細(xì)胞自噬,Giemsa染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰可以促進弓形蟲在HEF細(xì)胞內(nèi)的增殖,使用自噬抑制劑Bafilom