細(xì)胞自噬對TMV復(fù)制增殖的影響研究.pdf

1、細(xì)胞自噬（autophagy)，是真核生物中一種高度保守并普遍存在的物質(zhì)循環(huán)利用過程，對于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有極其重要的作用，細(xì)胞自噬與病毒的互作成為近年來研究的熱點(diǎn)。
　　本文研究了煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）在侵染感病寄主煙草（Nicotiana tabacum）過程中引起細(xì)胞自噬的現(xiàn)象。本研究利用 TMV-U1株系和普通煙（Nicotiana tabacum cv. Brightyel

2、low）為主要研究材料，利用透射電子顯微鏡（Trans-mission electron microscope，TEM）技術(shù)、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin，MDC）熒光染色技術(shù)、細(xì)胞自噬標(biāo)記分子 ATG8f-ECFP熒光觀察和熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分別檢測T MV侵染煙草后煙草細(xì)胞內(nèi)自噬結(jié)構(gòu)的形成、酸性細(xì)胞器的存在和細(xì)胞自噬相關(guān)基因（Autophagy related gene，ATG）ATG3、

3、ATG4、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8a、ATG18a的表達(dá)特征，明確了T MV侵染對寄主細(xì)胞自噬的影響。
　　為研究細(xì)胞自噬對TMV復(fù)制增殖的調(diào)控作用，構(gòu)建了TMV-GFP摩擦侵染體系，利用基因沉默技術(shù)沉默細(xì)胞自噬相關(guān)基因，然后采用TMV-GFP對ATGs沉默的植株進(jìn)行侵染，在長波紫外光下觀察TMV-GFP的復(fù)制量，同時(shí)采用qRT-PCR技術(shù)檢測TMV病毒含量的變化。具體結(jié)果如下：
　　1.電鏡結(jié)果顯示TMV侵染

4、72 h后葉片細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，觀察到較多的的類似自噬小泡的結(jié)構(gòu)，其大小約為300~900nm，同時(shí)在液泡內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多類似自噬小體的結(jié)構(gòu)。
　　2.MDC熒光染色技術(shù)顯示，在TMV侵染72 h后葉片細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的點(diǎn)狀陽性標(biāo)記物，而 PBS對照處理未發(fā)現(xiàn)顯著點(diǎn)狀陽性標(biāo)記物，對帶有熒光的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種TMV葉片的點(diǎn)狀陽性標(biāo)記物數(shù)量明顯多于PBS對照組，是PBS對照組的4~5倍。
　　3.自噬標(biāo)記分子ATG8f-E

5、CFP結(jié)果顯示，接種TMV72 h后葉肉細(xì)胞液泡內(nèi)出現(xiàn)青色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，而對照處理未發(fā)現(xiàn)典型青色點(diǎn)狀物。并且我們對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，結(jié)果表明T MV接毒處理葉片熒光強(qiáng)度明顯高于對照處理。
　　4.熒光定量PCR檢測TMV侵染后0、24、48、72和96 h接種的ATG3、ATG4、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8a和ATG18a的表達(dá)特征，結(jié)果表明ATG3、ATG4、ATG6、ATG7、ATG8a、ATG18a在48h分別開始

6、表達(dá)上調(diào)并持續(xù)至72 h，72 h的表達(dá)量分別為接種0 h的2.51倍、2.03倍、2.97倍、2.55倍、3.28倍、2.62倍，其中ATG7上調(diào)表達(dá)最為明顯，而ATG5表達(dá)無顯著變化。
　　5.沉默ATG3、ATG6和ATG7植株的TMV-GFP亮斑面積均大于對照植株，qRT-PCR檢測TMV-CP表達(dá)水平，結(jié)果表明沉默ATG3、ATG6和ATG7植株的TMV-CP表達(dá)量高于對照植株，說明寄主細(xì)胞自噬被抑制后，有利于T MV的