Annexin 1對增齡相關(guān)胰島β細(xì)胞增殖與自噬功能的影響及機(jī)制探討.pdf

1、本文以不同月齡組Wistar大鼠作為動物增齡模型，觀察增齡過程中胰島β細(xì)胞功能的變化以及胰島β細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、Annexin1蛋白表達(dá)的差異。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，體外通過抑制及增強(qiáng)MIN6細(xì)胞內(nèi)Annexin1蛋白的表達(dá)，探討Annexin1對增齡相關(guān)的胰島β細(xì)胞增殖、凋亡及自噬功能的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分增齡對大鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響
　　研究對象選取4月齡、14月齡和24月齡的雄性wistar大鼠

2、，分別代表青年組、中年組和老年組。觀察三組大鼠胰島的衰老指標(biāo)和胰島β細(xì)胞功能的變化。結(jié)果：①衰老指標(biāo)：大鼠胰島內(nèi)衰老相關(guān)蛋白p16的表達(dá)隨大鼠月齡增加而增多（p<0.05）。②β細(xì)胞功能應(yīng)用體內(nèi)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）和不同糖濃度刺激體外分離大鼠胰島胰島素釋放試驗(yàn)（GSIR）來進(jìn)行驗(yàn)證。OGTT結(jié)果顯示：與青年大鼠相比，中、老年大鼠血糖達(dá)峰時間延長，OGTT2h血糖增高，AUCg增加；FINS水平隨月齡逐步升高（p<0.01）。葡

3、萄糖刺激后，與青年組相比，老年組出現(xiàn)胰島素達(dá)峰時間延遲，ΔI10/ΔG10降低，AUCi增加（p<0.05）。GSIR結(jié)果顯示：隨大鼠月齡增加，胰島β細(xì)胞葡萄糖刺激胰島素釋放指數(shù)（GSIRindex）下降（p<0.05）。以上結(jié)果顯示大鼠胰島隨增齡逐漸衰老，隨著月齡的增加，大鼠糖耐量減低，胰島β細(xì)胞分泌胰島素能力下降。
　　第二部分增齡對大鼠胰島β細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響
　　研究對象同上。觀察胰島β細(xì)胞增殖、凋亡和胰島自

4、噬的改變。結(jié)果：①免疫組化結(jié)果顯示，隨著大鼠月齡增加，TUNEL陽性比例增多，胰島素和PCNA染色陽性比例減少。提示胰島素β細(xì)胞隨月齡增加，細(xì)胞增殖減少，凋亡增加；②應(yīng)用Westernblot結(jié)果顯示：隨大鼠月齡增加，胰島內(nèi)LC3表達(dá)、LC3II/I比值以及Atg7蛋白表達(dá)逐漸降低，而p62及polyUB表達(dá)升高（p<0.05）；青年大鼠胰腺內(nèi)Beclin-1/Atg6表達(dá)量較少，中年后明顯增多，但在老年組表達(dá)量又出現(xiàn)降低趨勢。提示隨著

5、大鼠月齡增加，胰島自噬功能下降。
　　第三部分AnnexinI調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和自噬的機(jī)制研究
　　研究3組大鼠胰腺內(nèi)Annexin1蛋白表達(dá)差異。以MIN6細(xì)胞為模型，通過抵制與增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Annexin1蛋白的表達(dá)，利用CCK-8技術(shù)觀察細(xì)胞增殖活性改變，利用westernblot技術(shù)分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及蛋白激酶表達(dá)變化，同時觀察此過程中PI3K-Akt-mTOR信號通路的變化；觀察凋亡相關(guān)蛋白以及自噬相關(guān)蛋白LC3/

6、Atg8及p62表達(dá)。結(jié)果：①免疫組化結(jié)果顯示：隨大鼠月齡增加，胰島內(nèi)Annexin1表達(dá)逐漸減少。②通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Annexin1蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Annexin1可促進(jìn)β細(xì)胞增殖；與cyclinD1、cyclinE、CDK2表達(dá)及PI3K-Akt-mTOR信號通路的活性正相關(guān)；而凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達(dá)無明顯變化；在自噬方面，Annexin1與β細(xì)胞內(nèi)LC3II表達(dá)、LC3II/I比

7、值呈正相關(guān)，而與p62表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（p<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大鼠胰島內(nèi)Annexin1表達(dá)具有年齡依賴性，且Annexin1蛋白可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及蛋白激酶、激活PI3K/Akt/mTOR信號通路來促進(jìn)β細(xì)胞增殖，可增強(qiáng)胰島的自噬功能。但與β細(xì)胞的凋亡可能無相關(guān)性。
　　綜上所述，增齡過程中大鼠胰島素分泌減少，可能涉及的機(jī)制有胰島β細(xì)胞量減少、胰島β細(xì)胞功能降低。隨增齡胰島β細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡增加可能是導(dǎo)致數(shù)量減