溫?zé)釋?duì)HPV感染細(xì)胞中自噬的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是屬于定向感染人體皮膚和黏膜的一類乳頭瘤病毒。根據(jù)病毒基因序列不同，HPV明確的亞型有120多種，且表現(xiàn)為明顯的組織特異性。皮膚型HPV引起的良性的臨床疾病為皮膚疣（瘤），粘膜型HPV則誘導(dǎo)良性乳頭狀瘤，可引起生殖器黏膜上皮腫瘤，如消化道、呼吸道的腫瘤。按其生物學(xué)行為不同可分高危型和低危型。HPV高危型可誘導(dǎo)發(fā)病率和死亡率較高的宮頸癌。然而無論何種型別的HPV，均具有

2、高度嗜上皮性并有促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的能力，引起皮膚和黏膜異常增生。HPV廣泛存在于自然界中，HPV感染具有極強(qiáng)的地域性，世界上不同國家地區(qū)HPV的感染率和分布不同。美國已注冊(cè)了3種針對(duì)HPV感染預(yù)防的疫苗，但對(duì)于人乳頭瘤病毒治療性疫苗相對(duì)于已上市的預(yù)防性疫苗進(jìn)展緩慢，更具有挑戰(zhàn)性。主要原因是對(duì)機(jī)體如何進(jìn)行自身控制及清除HPV感染的細(xì)胞的機(jī)制不清楚。根據(jù)HPV感染的亞型、部位不同，治療的方案也有所區(qū)別。因此，尋找有效的更加適合國人的預(yù)防

3、和治療HPV感染的方法尤為重要。
　　一定溫度、時(shí)間的溫?zé)釋?duì)于一些疾病已有明確的療效。并且具有安全、無痛、可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)。因此更容易被患者接受，并在臨床上開展?，F(xiàn)已在乳腺癌、肺癌等癌癥的治療過程中取得了確切的療效。近年來，溫?zé)嵩谄つw科也得到了充分研究與應(yīng)用。如皮膚腫瘤、皮膚真菌感染、皮膚HPV病毒感染等。本實(shí)驗(yàn)基于自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)研發(fā)的溫?zé)嶂委焹x（專利號(hào)zl200820231952.4.）的前期療效研究所做的統(tǒng)計(jì)分析，尤其在治療趾疣方面

4、，照比常規(guī)療法的治愈率高達(dá)近10個(gè)百分點(diǎn)。并利用該技術(shù)成功治療復(fù)雜性人乳頭瘤病毒感染性皮膚病和多種難治性其他疾病，并成功發(fā)表多篇SCI論著。研究證明溫?zé)峥梢允拐Ｆつw及HPV感染的皮膚發(fā)生凋亡，并且在后者發(fā)揮更大效果。通過研究，溫?zé)岷蟀l(fā)生凋亡主要原理可能是通過溶解角質(zhì)形成細(xì)胞釋放HPV成分來促發(fā)特異性免疫系統(tǒng)從而消滅HPV。但對(duì)于如何發(fā)揮該作用的確切機(jī)理尚未明確。
　　最新研究證明溫?zé)峥梢哉T發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，并呈溫度依賴性。細(xì)胞

5、自噬是通過清除體內(nèi)功能紊亂的蛋白或受損的細(xì)胞器維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種重要降解過程。主要分為以下三種方式:1、大自噬;2、小自噬;3、分子伴侶介導(dǎo)的自噬。多種病理生理狀態(tài)均可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。自噬參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控。自噬發(fā)生可通過多條信號(hào)調(diào)節(jié)途徑。最新的研究表明，自噬在感染性皮膚病、銀屑病、光損傷、自身免疫性疾病、皮膚惡性腫瘤中也起到重要的作用。
　　細(xì)胞增殖、衰老和死亡是構(gòu)成體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的重要機(jī)制，目前依據(jù)形態(tài)學(xué)的不同，將細(xì)胞死

6、亡分為凋亡、自噬和壞死。由于其種類的多樣性及機(jī)制的復(fù)雜性，它們之間不可避免存在交叉形成聯(lián)系，近年來越來越多證據(jù)顯示，細(xì)胞自噬跟凋亡在某些情況下存在協(xié)助或拮抗等關(guān)系。
　　基于以上理論基礎(chǔ)，溫?zé)峥梢哉T發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，且可引起HPV感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡又與自噬之間存在協(xié)同拮抗等復(fù)雜關(guān)系，那是否可以證明自噬在溫?zé)嶂委烪PV感染皮膚病中起著一定作用，尚需進(jìn)一步研究，這將為溫?zé)嶂委烪PV感染性疾病提供理論依據(jù)。
　　研究方法:

7、1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象:細(xì)胞系來自表達(dá)不同HPV拷貝數(shù)的宮頸癌細(xì)胞系(CaSki、SiHa、C33A)和永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)作為研究對(duì)象。體外溫?zé)岬慕M織標(biāo)本來自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診臨床診斷為尖銳濕疣的患者，收集經(jīng)二氧化碳點(diǎn)陣激光切除皮損部分的殘余。2、溫?zé)嶂委煼桨?體外溫?zé)?水浴鍋加熱，將尖銳濕疣組織一式兩份，浸潤至培養(yǎng)基內(nèi)，分別給予37℃、44℃溫?zé)?0分鐘處理，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)。細(xì)胞溫?zé)?采用水浴鍋加熱方式

8、，方法同體外溫?zé)帷?、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和P62 mRNA的表達(dá):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)LC3，P62 mRNA的表達(dá)。按照Qiagen提取試劑說明書提取總RNA;用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; GoTaq(@)qPCR Master Mix(Promega)試劑盒行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分

9、析。4、Western blot檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá):采用Westernblot方法檢測(cè)溫?zé)崆昂驦C3蛋白表達(dá)水平的變化（LC3是自噬的標(biāo)志物，自噬一旦形成，胞漿型LC3，即LC3-Ⅰ會(huì)酶解掉一小段肽段，轉(zhuǎn)變膜性，即LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值大小可評(píng)估自噬水平高低）。應(yīng)用BCA試劑盒提取細(xì)胞中蛋白并檢測(cè)蛋白濃度;經(jīng)制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗過夜、二抗等過程，最終進(jìn)行顯色觀察。5、免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白:石蠟切片4μm，用免疫組化染

10、色技術(shù)(SP法)檢測(cè)LC3表達(dá)。石蠟組織切片經(jīng)多次脫蠟、抗原修復(fù)、一抗、二抗、顯色、復(fù)染等，在20倍物鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，并用Image-pro Plus軟件分析平均光密度值。6、MTS檢測(cè)溫?zé)釋?duì)細(xì)胞增殖的影響:利用MTS方法檢測(cè)溫?zé)釋?duì)細(xì)胞增殖的影響。將四種細(xì)胞分別接種在96孔板中，分別進(jìn)行37℃和44℃溫?zé)崽幚?，分別于第0、1、2、和第3天進(jìn)行吸光度值檢測(cè)。7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)溫?zé)釋?duì)細(xì)胞周期的影響:利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)溫?zé)釋?duì)細(xì)胞周期影響

11、。將細(xì)胞接種于六孔板中，分別進(jìn)行37℃、44℃處理。之后應(yīng)用PI試劑檢測(cè)細(xì)胞的周期的分布。8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用GraphPad Prim軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析或unpaired t test。比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異，P值＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:1、溫?zé)釋?duì)細(xì)胞中自噬表達(dá)的影響:利用RT-PCR、Western-Blot方法觀察到三種不同拷貝數(shù)的宮頸癌細(xì)胞系及角質(zhì)形成細(xì)胞在溫?zé)崽幚砗笞允上?/p>

12、關(guān)基因、蛋白表達(dá)水平均有不同程度的增高。免疫組織化學(xué)方法觀察LC3在各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LC3在HPV感染皮膚組織中呈陽性表達(dá)，溫?zé)崽幚砗蟊磉_(dá)水平增高。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。2、溫?zé)釋?duì)細(xì)胞增殖及周期的影響:44℃處理后，四種細(xì)胞的增殖水平對(duì)比37℃時(shí)有所下降，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種細(xì)胞在溫?zé)崽幚砗?，G2M期發(fā)生阻滯。
　　結(jié)論:1、溫?zé)峥商岣逪PV感染細(xì)胞中自噬水平的表達(dá)。2、溫?zé)崽幚砗笠种艸PV感染細(xì)