溫熱對HPV感染細胞中APOBEC3的影響及機制探討.pdf

1、目的：
　　本實驗擬回答如下問題:APOBEC3在良性增生性皮損、癌前病變、原位癌及皮膚腫瘤中表達是否存在差異？IFN是公認的誘導內(nèi)源性APOBEC表達增加的原因之一。那么溫熱在治療HPV感染性疾病中是否會促進APOBEC表達增加，以及APOBEC是否通過脫氨酶機制發(fā)揮抗病毒作用？為解決上述問題，本實驗首先利用免疫組織化學技術(shù)檢測APOBEC3A和3G在尖銳濕疣、鮑溫病、鮑溫樣丘疹病、日光性角化病、鱗狀細胞癌組織中的表達，其次采用

2、Real-time PCR和3D-PCR技術(shù)檢測尖銳濕疣和宮頸癌細胞系經(jīng)體內(nèi)、體外溫熱后APOBEC3A和3G的表達以及對HPV的編輯作用，最后采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達APOBEC3A的宮頸癌細胞系，觀察APOBEC3A的生物學功能并探討可能的分子機制，為研究溫熱治療HPV感染性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、實驗對象
　　石蠟組織切片標本來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科2008～2013年存檔的，經(jīng)病

3、理組織學結(jié)果證實為尖銳濕疣、鮑溫病、鮑溫樣丘疹病、日光性角化病和鱗狀細胞癌的組織。體內(nèi)及體外溫熱組織標本來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科門診診斷為尖銳濕疣患者的組織，符合2014年衛(wèi)生部防疫司制定的診斷標準。患者或其監(jiān)護人知情同意，獲得中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準，并符合赫爾辛基宣言。細胞系選擇為表達不同HPV拷貝數(shù)的宮頸癌細胞系(CaSki、SiHa、C33A)作為研究對象。
　　二、溫熱治療方案
　　采

4、用自主研制的溫熱治療儀（專利號ZL200720185403.3，中國醫(yī)科大學），給予非接觸式的定點加熱方法，通過紅外體溫檢測儀反饋溫度，使其保持在指定的溫度范圍內(nèi)。
　　體內(nèi)溫熱:選取靶疣（較大疣體或解剖部位方便照射的疣體）進行局部44℃溫熱治療，連續(xù)治療3天，每天1次，每次30分鐘。間隔7-10天，再連續(xù)治療2天，每天1次，每次30分鐘。后每間隔7天進行1次治療，直至疣體消退。3個月時觀察臨床療效。
　　體外溫熱:將尖銳濕

5、疣組織一式三份，真皮側(cè)浸潤至培養(yǎng)基內(nèi)，表皮側(cè)暴露于空氣中，分別給予37℃、42℃和45℃溫熱30分鐘，常規(guī)培養(yǎng)12小時。
　　細胞溫熱:采用水浴鍋加熱方式，方法同體外溫熱。
　　三、免疫組化檢測相關(guān)蛋白
　　石蠟切片4μm，用免疫組化染色技術(shù)(SP法)檢測APOBEC3A和3G表達。石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、抗原修復、一抗、二抗、顯色、復染并拍照，在20倍物鏡下隨機選取5個視野，利用Image-pro Plus軟件分析平均光

6、密度值。
　　四、實時熒光定量PCR檢測APOBEC3A和3G mRNA的表達
　　采用實時熒光定量PCR方法檢測APOBEC3A和3G mRNA的表達。按Qiagen提取試劑說明書提取總RNA;用PrimeScript RT regagent Kit(Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; SYBR Premis Ex Taq(Takara)試劑盒行實時熒光定量PCR擴增，采用雙標準曲線法行相對定量結(jié)果分析。
　　

7、五、Western blot檢測APOBEC3A和3G蛋白的表達
　　采用Western blot方法檢測溫熱前后APOBEC3A和3G蛋白表達水平的變化。按照蛋白提取法提取細胞中蛋白;BCA檢測蛋白濃度;經(jīng)制膠、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、ECL顯色并拍照，觀察蛋白表達變化。
　　六、3D-PCR擴增HPV E2基因時變性溫度的變化
　　利用3D-PCR方法檢測HPV E2基因擴增時的變性溫度。按Qiagen提取試

8、劑說明書提取總DNA;用GoTaq Colorless Master Mix(Promega)試劑盒擴增HPV E2基因，通過改變變性溫度觀察PCR擴增情況，推測是否存在G-A和C-T的突變。
　　七、MTS檢測APOBEC3 A對細胞增殖的影響
　　利用MTS方法檢測APOBEC3A對細胞增殖的作用。將轉(zhuǎn)染APOBEC3A基因組和空白對照組細胞接種于96孔板中，分別于第0天、1天、2天、3天和4天進行檢測，490nm處觀察

9、吸光度值。
　　八、流式細胞術(shù)檢測APOBEC3A對細胞周期和凋亡的影響
　　利用流式細胞術(shù)檢測APOBEC3A對細胞周期和凋亡的影響。將轉(zhuǎn)染APOBEC3A基因組和空白對照組細胞接種于六孔板中，用FITC AnnexinⅤ凋亡試劑盒和PI試劑分別檢測細胞凋亡的變化和周期的分布。
　　九、統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prim軟件對資料進行統(tǒng)計學分析。僅有兩組數(shù)據(jù)時測得結(jié)果采用(x)±S表示，比較采用unpaired

10、 t test或Mann-Whitney test。超過兩組數(shù)據(jù)時比較采用方差分析。P＜0.05時具有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果：
　　1、APOBEC3A和3G在皮膚腫瘤性疾病中的表達
　　利用免疫組織化學方法觀察APOBEC3A和3G在各組織中的表達情況。結(jié)果顯示，APOBEC3A在正常皮膚中呈陽性表達，APOBEC3G則呈陰性或弱陽性表達，而兩者在腫瘤性疾病中表達量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

11、r>　　2、溫熱對HPV感染組織和細胞中APOBEC3A和3G表達的影響
　　三種含有HPV16不同拷貝數(shù)的宮頸癌細胞系，經(jīng)37℃、42℃和45℃處理后，細胞中的APOBEC3A和3G表達水平增高，且呈溫度依賴性。同時，除與溫度呈正相關(guān)外，與細胞中病毒拷貝數(shù)也密切相關(guān)。病毒拷貝數(shù)越高，細胞對溫熱處理越敏感，APOBEC3A和3G增高的水平也越顯著。而不含HPV的C33A細胞溫熱處理前后APOBEC3A和3G表達水平無明顯變化。尖銳

12、濕疣患者皮損體外溫熱后APOBEC3A和3G變化水平同上。
　　3、溫熟對宮頸癌細胞中HPVE2基因的影響
　　首先采用3D-PCR技術(shù)觀察溫熱處理前后，HPVE2基因擴增時變性溫度的變化，推測病毒序列是否發(fā)生突變。結(jié)果顯示，44℃溫熱后的CaSki細胞HPVE2基因經(jīng)PCR擴增時變性溫度從85.5℃降低到83.7℃，而SiHa細胞溫熱處理后PCR擴增的變性溫度則從85.5℃降低到84.1℃。DNA測序結(jié)果明確基因突變個數(shù)，

13、結(jié)果為溫熱后CaSki細胞共產(chǎn)生12個G-A和18個C-T的突變，SiHa細胞共產(chǎn)生9個G-A和12個C-T的突變，推測溫熱后誘導的APOBEC3A和3G水平的增加很可能是E2基因發(fā)生突變的重要原因。
　　4、溫熱治療對尖銳濕疣患者皮損中APOBEC3A和3G的影響
　　共有6例多發(fā)性尖銳濕疣患者接受溫熱治療，分別于治療前、治療2周、6周行活組織檢查。其中4例患者在治療第6周時部分皮損出現(xiàn)消退，1例患者于治療第4周時皮損完全

14、消退，1例患者治療3個月無效后采取手術(shù)治療。
　　(1)、溫熱治療前后APOBEC3A和3G mRNA的表達
　　溫熱治療后疣體局部APOBEC3A和3G mRNA表達量升高，且隨著治療時間延長，增加更為明顯。但療效較差的1例患者，治療前后APOBEC3A和3G表達水平未見明顯變化。
　　(2)、溫熱治療前后HPVE2基因突變個數(shù)
　　溫熱治療后疣體局部HPV E2基因擴增時變性溫度降低，且隨著治療周期延長，變性

15、溫度進一步降低。DNA測序結(jié)果顯示，溫熱后的疣體中含有更多的G-A和C-T的突變，尤其在治療效果較好的患者中，突變個數(shù)顯著增高，而治療效果欠佳的患者未見明顯E2基因突變。
　　5、APOBEC3A對宮頸癌細胞生物學功能的影響
　　(1)、建立過表達APOBEC3A的宮頸癌細胞系，結(jié)果顯示APOBEC3A可以抑制宮頸癌細胞生長，尤其在含有高病毒拷貝數(shù)的CaSki細胞中，抑制作用從第3天持續(xù)至第4天。同時流式細胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CaS

16、ki細胞中，轉(zhuǎn)染APOBEC3A基因后，G1期細胞比例從53.92％增長到60.31％，S期細胞比例則從30.85％降至25.82％。SiHa細胞未見明顯變化。此外，轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡水平均未見明顯變化。
　　(2)、過表達APOBEC3A基因的CaSki細胞和SiHa細胞，與對照組相比，E2基因擴增時變性溫度明顯降低，分別從85.2℃下降到84.6℃和85.5℃下降到84℃，同時過表達APOBEC3A的細胞中，HPVE2基因的G-

17、A和C-T的突變頻率明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1、APOBEC3A和3G的表達可能與皮膚腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)，具有重要的臨床與科研價值。
　　2、溫熱可提高HPV感染細胞中APOBEC3A和3G的表達，且呈溫度依賴性，并與病毒拷貝數(shù)密切相關(guān)。
　　3、溫熱處理后HPVE2基因中G-A和C-T的突變頻率增加，這很可能是溫熱治療HPV相關(guān)疾病另一重要機制，為臨床治療提供新的靶點。
　　4、尖銳