薯蕷皂苷對MC3T3-E1細胞增殖分化的影響及機制探討.pdf

1、目的：研究中藥山藥有效成分薯蕷皂苷（Dioscin，DIO）對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性和成骨性分化的影響，確定最佳活性濃度及處理時間。通過檢測β-catenin， runx2，CyclinD1的轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平，探討薯蕷皂苷影響MC3T3-E1細胞增殖分化的作用機理。
　　方法：⑴通過熒光倒置顯微鏡觀察對數(shù)生長期MC3T3-E1細胞形態(tài)。⑵不同濃度（1,0.1,0.01,0.001,0μM）DIO分別處理細胞24h、48

2、h、72h，MTT法檢測DIO作用不同時間對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響，分析促增殖能力的活性濃度及最佳時間。DIO分別作用細胞最佳時間后，碘化丙啶染色，應用流式細胞技術(shù)檢測細胞周期，Real-time PCR檢測成骨細胞增殖相關(guān)基因Ki67、PCNA mRNA的表達。⑶不同濃度（1,0.1,0.01,0.001,0μM）DIO處理細胞15d，磷酸苯二鈉法檢測DIO對細胞內(nèi)堿性磷酸酶ALP活性的影響，處理細胞21d，茜素紅染色檢測

3、DIO對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的影響。Real-time PCR檢測DIO處理細胞48h對成骨細胞分化標志物BGP、OPN mRNA表達的影響。⑷Real-time PCR法檢測活性濃度（0.01,0.001μM）DIO處理MC3T3-E1細胞48h后β-catenin， runx2，CyclinD1的轉(zhuǎn)錄水平。⑸活性濃度（0.01,0.001μM）DIO處理MC3T3-E1細胞48h后，Western-blot法檢測蛋白β-catenin，

4、 runx2，CyclinD1的表達水平。
　　結(jié)果：①MTT法檢測結(jié)果顯示，0.01,0.001μM濃度組的DIO在作用24h、48h后，均能促進成骨細胞增殖(P＜0.05)，作用48h促增殖效果較強。流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，0.01,0.001μM濃度組的DIO作用成骨細胞48h后，能夠顯著增加細胞周期S期的比例(P＜0.05)。②Real-time結(jié)果顯示，0.01μM DIO減少Ki67 mRNA的表達(P＜0.01)，

5、而0.001μM DIO增加Ki67 mRNA的表達(P＜0.05)；各濃度的DIO對PCNA基因的轉(zhuǎn)錄無明顯影響(P＞0.05)。③DIO處理細胞15d后，ALP活性檢測結(jié)果顯示，0.01,0.001μM濃度組的DIO顯著提高成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性(P＜0.01)。作用21d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，0.01,0.001μM濃度組的DIO提高成骨細胞礦化結(jié)節(jié)量(P＜0.001)。④Real-time PCR結(jié)果顯示BGP，OPN基因的

6、轉(zhuǎn)錄水平提高(P＜0.05)。⑤Real-time PCR結(jié)果顯示，（0.01,0.001μM）DIO runx2，CyclinD1 mRNA的轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，降低β-catenin mRNA的轉(zhuǎn)錄(P＜0.001)。⑥Western-blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因β-catenin， runx2， CyclinD1的翻譯水平均下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：薯蕷皂苷具有促進MC3T3-E1細胞增殖及成骨性分化的