Intermedin對小鼠MC3T3-E1細胞增殖、凋亡、分化及RANKL-OPG-M-CSF表達的影響.pdf

1、目的：
　　骨重建是人體健康骨組織的重要生理程序，它由骨形成和骨吸收共同完成。骨形成主要通過成骨細胞的增殖、分化來實現(xiàn)，而骨吸收則是由破骨細胞來完成，二者相互影響，維持一種平衡的生理狀態(tài)。當這種平衡被破壞以后會導致多種病理情況，其中就包括骨質(zhì)疏松。
　　現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)的降鈣素基因相關肽超家族包括7個成員:降鈣素(Calcitonin，CT)胰淀粉酶(Amylin)，兩種降鈣素基因相關肽(CGRP)，腎上腺髓質(zhì)素(Adrenom

2、edullin，AMD)，降鈣素受體刺激肽(calcitonin receptor-stimulating peptide，CRSP)以及垂體中介素(Intermedin，IMD)。Intermedin(IMD)是最近發(fā)現(xiàn)的降鈣素基因相關肽家族的新成員，它在人體很多組織都有表達，比如:胃腸道、肺、下丘腦、腎上腺及心臟等組織器官。與其他降鈣素基因家族相關肽成員相似，IMD通過與降鈣素樣受體CRLR結合激活受體活化蛋白RAMP1/RAMP2

3、/RAMP3發(fā)揮生物學效用。它對骨吸收的作用與降鈣素(CT)和降鈣素基因相關肽(CGRP)的作用相似，都可以抑制骨吸收，但是它的作用機制還沒有被完全研究透徹。
　　本實驗采用不同濃度的IMD(0、1、10和100nM）干預小鼠MC3TC-E1成骨細胞，通過MTT、流式細胞儀、real time PCR和western blot等試驗方法檢測IMD對MC3TC-E1細胞的增殖、分化、凋亡及RANKL/OPG/M-CSF表達的影響，進

4、一步完善IMD對骨重建的影響機制。
　　材料和方法：
　　1、材料
　　(1)細胞系小鼠成骨細胞系MC3T3-E1(ATCC)。
　　(2)主要試劑 Intermedin/IMD（美國鳳凰制藥）、AnnexinⅤ-FITC/PI(BD)、MTT試劑盒(sigma)，Caspase-3活性試劑盒(Promega) OPG、RANKL、M-CSF和Caspase-3抗體(santa)，引物和PCR試劑盒(TaKaRa

5、)。
　　2、實驗方法
　　(1)不同濃度IMD干預小鼠MC3T3-E1細胞，應用MTT方法檢測IMD對成骨細胞增殖的影響;
　　(2)無血清或者地塞米松誘導MC3T3-E1細胞凋亡，同時加入不同濃度IMD干預，應用流式細胞術檢測IMD對成骨細胞凋亡;
　　(3)不同濃度IMD干預MC3T3-E1細胞，應用Real time PCR技術檢測OCN，BSP及RANKL/OPG/M-CSF nRNA的表達;
　

6、　(4)不同濃度IMD干預MC3T3-E1細胞，應用Western blot方法檢測Caspase-3，RANKL/OPG/M-CSF蛋白的表達;
　　(5)細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)MC3T3-E1細胞系;
　　(6)成骨誘導分化，同時加入不同濃度的IMD干預，應用茜素紅染色和ALP活性測定檢測成骨細胞分化。
　　3、統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，采用t檢驗和單因素

7、方差分析的統(tǒng)計方法，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、細胞增殖不同濃度IMD干預MC3T3-E1細胞后，采用MTT法檢測細胞的增值率，結果顯示不同濃度IMD組與空白對照組的增值率無統(tǒng)計學差異。
　　2、細胞分化不同濃度IMD干預MC3T3-E1細胞后，結果顯示不同濃度IMD組與空白對照組的ALP活性、OCN/BSP mRNA表達和茜素紅染色均無統(tǒng)計學差異。
　　3、細胞凋亡不同濃度IMD干預無

8、血清或者10-7M地塞米松誘導細胞凋亡后，100nM IMD組較無血清組或10-7 M地塞米松組的annexinⅤ/PI染色率和Caspase-3活性顯著降低(p＜0.01)。
　　4、RANKL/OPG/M-CSF不同濃度IMD干預MC3T3-E1細胞后，100nM IMD組的RANKL及M-CSF表達量顯著低于對照組，OPG的表達量顯著高于對照組(p＜0.01)。
　　結論：
　　1、IMD對MC3T3-E1細胞的