松脂素二葡萄糖苷對MC3T3-E1成骨細胞OPG以及RANKL表達的影響.pdf

1、目的：目前對骨質疏松癥的防治問題已經引起全球的關注。迄今為止對骨質疏松癥尚無特效藥物。國內外實驗證明，杜仲單體成分可促進成骨細胞增殖分化并可上調成骨細胞OPG/RANKL的比值，但目前對杜仲的研究多關注于杜仲整體，對其單體及化合物成分的研究較少。本實驗著眼于杜仲單體成分松脂素二葡萄糖苷對MC3T3-E1成骨細胞的研究，應用松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞，觀察其對MC3T3-E1成骨細胞的增殖分化的作用和對OPG及RANKL

2、表達的影響，進而為松脂素二糖苷對骨質疏松癥的臨床應用提供依據(jù)。
　　方法：
　　本實驗從松脂素二葡萄糖苷對MC3T3-E1成骨細胞增殖、分化以及對其OPG以及RANKL表達的影響兩部分分別進行。
　　第一部分:各實驗組細胞分別加入含不同濃度的松脂素二葡萄糖苷:0mg/ml、10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml的含10％胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞，用MTT法確定松脂素二葡萄

3、糖苷培養(yǎng)液對MC3T3-E1成骨細胞的增殖作用。然后用以上三種濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞，檢測ALP的活性，以評價松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對MC3T3-E1成骨細胞的分化作用。最后用茜素紅染色法顯微鏡下觀察三種不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對MC3T3-E1成骨細胞的鈣化作用。
　　第二部分:各實驗組細胞分別加入含不同濃度的松脂素二葡萄糖苷:0mg/ml、10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4

4、×10-9mg/ml的含10％胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞，用半定量PCR法觀察三種不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對MC3T3-E1成骨細胞的OPG和RANKL的轉錄情況，評價松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對MC3T3-E1成骨細胞OPG及RANKL表達的影響。
　　結果：
　　第一部分:(1)不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)期間，MC3T3-E1成骨細胞生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細胞大量死亡的情況。(2) MTT顯

5、示10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml用藥各組與DMSO對照組和空白組比較，均能促進MC3T3-E1的增殖，且差異具有顯著性(P＜0.01)。(3)松脂素二葡萄糖苷用藥各組與空白對照組以及DMSO對照組相比較，均能促進MC3T3-E1成骨細胞分泌ALP，且具有顯著性差異（P＜0.05），呈濃度依賴性。10-7mg/ml組的ALP含量明顯高于空白組和DMSO組，差異具有顯著性(P＜0.01)。(4)松脂素二葡

6、萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)14天后，茜素紅染色結果顯示用藥各組染色較深，鈣結節(jié)含量豐富，而對照組及空白組染色較淺，鈣結節(jié)含量少，提示松脂素二葡萄糖苷能夠促進MC3T3-E1細胞的成骨分化。
　　第二部分:(1)不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)期間，MC3T3-E1成骨細胞生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細胞大量死亡的情況。(2)通過對MC3T3-E1OPGmRNA表達的半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，用藥各組與空白組及對照組相比較，光密度值明顯增加，差

7、異具有顯著性（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，OPGmRNA的水平逐漸增加，提示松脂素二葡萄糖苷可以促進MC3T3-E1OPGmRNA的表達，且具有濃度依賴性。(3)通過對MC3T3-E1 RANKL mRNA表達的半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，用藥組與與空白組及對照組相比較，光密度值明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，RANKL mRNA的水平逐漸降低，提示松脂素二葡萄糖苷可以促進MC3T3-E1OPG

8、 mRNA的表達，且具有濃度依賴性。
　　結論：
　　本實驗通過MTT法及檢測ALP的活性和茜素紅染色，證明了松脂素二葡萄糖苷對MC3T3-E1成骨細胞分化成熟及增殖所起到的重要作用。并且松脂素二葡萄糖苷可通過促進成骨細胞表達OPG，并抑制其表達RANKL，進而抑制破骨細胞的分化與成熟;同時進一步研究了隨著藥物濃度的增加，OPG mRNA的表達逐漸增加而RANKL mRNA的表達逐漸減少，為篩選促進骨形成的有效藥物提供了作用