降鈣素基因相關(guān)肽對血清饑餓條件下MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡和自噬的影響.pdf

1、在骨折愈合過程中，成骨細(xì)胞是骨修復(fù)和骨重建最為重要的細(xì)胞之一，主要依賴于微環(huán)境中連綿不絕的營養(yǎng)供應(yīng)及促生存信號才能維持其正常的生理功能;當(dāng)骨組織發(fā)生病變或者損傷導(dǎo)致營養(yǎng)因子供應(yīng)受到限制時(shí)，成骨細(xì)胞將會(huì)發(fā)生超出正常生理狀態(tài)的凋亡率，由此對骨的重塑造成了嚴(yán)重的影響。
　　研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)骨組織的各項(xiàng)生理功能，降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）作為廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，對骨形成和骨吸收起著重要的作用。本課題組在前期研究中已經(jīng)

2、證實(shí)CGRP在頜骨骨折的愈合過程中起著重要的促進(jìn)作用。成骨細(xì)胞表面存在CGRP受體，CGRP通過結(jié)合受體發(fā)揮對成骨細(xì)胞活性的直接調(diào)節(jié)作用，CGRP對成骨細(xì)胞的作用分子機(jī)制已有大量研究。近期研究證明CGRP能夠通過抑制成骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)而抑制骨的丟失，對成骨細(xì)胞具有潛在的保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不完全清楚。
　　自噬(autophagy)是一種細(xì)胞應(yīng)對不利環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制，是將受損或異常的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)通過雙層膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)至溶酶體

3、降解循環(huán)再利用的過程。凋亡（apoptosis）是細(xì)胞受基因控制的一種主動(dòng)的有序的死亡方式。骨折愈合過程中同時(shí)伴隨著凋亡與自噬的發(fā)生，兩者如何互相作用共同促進(jìn)骨折愈合的具體機(jī)制尚不清楚。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證CGRP對饑餓條件下成骨細(xì)胞抗凋亡作用，發(fā)現(xiàn)其對饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬活性的影響作用，再對兩者相互的關(guān)系進(jìn)行了初步的探索。首次從自噬入手，試圖進(jìn)一步揭示CGRP對成骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：<

4、br>　　成骨細(xì)胞于血清饑餓條件（α-MEM培養(yǎng)基、0％FBS、100U/ml青-鏈霉素）下培養(yǎng)12h、24h后通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting分別檢測其凋亡率和自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)。自噬抑制劑3-MA預(yù)處理成骨細(xì)胞細(xì)胞1h后血清饑餓培養(yǎng)24h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。在血清饑餓條件下加入不同濃度的CGRP培養(yǎng)24h，采用Western blotting檢測LC3蛋白和P62蛋白，篩選出對自噬優(yōu)勢作用濃度;通過加

5、入CGRP后不同時(shí)間段采用Western blotting檢測LC3蛋白，篩選出CGRP作用于饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬作用的優(yōu)勢作用時(shí)間段。CGRP作用于血清饑餓條件下培養(yǎng)成骨細(xì)胞24h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，并采用共聚焦激光顯微鏡觀察MDC染色細(xì)胞自噬體和LC3免疫熒光染色。在血清饑餓條件下使用自噬抑制劑抑制3-MA預(yù)處理細(xì)胞后加入CGRP培養(yǎng)24h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.血清饑餓會(huì)誘導(dǎo)成骨

6、細(xì)胞凋亡率升高，通過Western blot檢測顯示血清饑餓會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高。
　　2.自噬抑制劑3-MA預(yù)處理可以增加血清饑餓條件下成骨細(xì)胞凋亡率。
　　3.CGRP可以抑制血清饑餓誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡。CGRP作用于血清饑餓條件下成骨細(xì)胞24h，隨著加入CGRP濃度的逐漸升高，LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異逐漸上升，P62表達(dá)逐漸下降，在CGRP濃度為10-8mol/L是差異較為明顯。CGRP作用于血清饑餓條件下成

7、骨細(xì)胞不同時(shí)間段，在24h時(shí)LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異最為明顯。CGRP誘導(dǎo)血清饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬體形成及LC3蛋白表達(dá)。
　　4.自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后可以增加血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的凋亡率，CGRP則能部分逆轉(zhuǎn)自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后所致的血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.本研究驗(yàn)證血清饑餓會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡及自噬活性的升高，抑制血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的自噬活性會(huì)誘導(dǎo)凋亡率的升高。