OTX2基因表達下調(diào)對MC3T3-E1細胞增殖和自噬影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用靶向設(shè)計的OTX2基因小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染小鼠成骨細胞系MC3T3-E1，下調(diào)OTX2基因的表達，研究對MC3T3-E1細胞增殖以及自噬水平的影響。
　　方法：
　　根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中小鼠的OTX2基因序列，設(shè)計靶向的三對小干擾RNA序列(OTX2-siRNA)。
　　常規(guī)培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞，將實驗分為5組:OTX2-mus-868組，OTX2-mus-1027組，OTX2-m

2、us-1225組，陰性對照組，空白對照組。利用siRNA-mate轉(zhuǎn)染試劑對MC3T3-E1細胞進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，對各組細胞進行檢測。免疫細胞化學(xué)染色驗證成骨細胞的干擾效率并分析陽性細胞的百分比，篩選出三對siRNA中干擾效率最優(yōu)的一組。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定細胞增殖;流式細胞儀檢測細胞周期;MDC熒光染色檢測細胞的自噬水平。利用SPSS21.0軟件對多組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。
　　結(jié)果：
　　1、免疫

3、細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，實驗組細胞出現(xiàn)OTX2蛋白表達水平下調(diào)，細胞染色強度明顯減弱，陽性細胞的百分比明顯減少，其中OTX2-mus-868組最為顯著，干擾效率最高，與陰性對照組和空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　2、MTT實驗結(jié)果顯示，實驗組OD值小于陰性對照組和空白對照組，細胞增殖抑制率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　3、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:實驗組細胞的S期所占的百分比減少，S期細

4、胞比率以及細胞的增殖指數(shù)小于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4、MDC熒光染色結(jié)果顯示:熒光顯微鏡下觀察，實驗組染色強度弱，點狀結(jié)構(gòu)少，陰性對照組和空白對照組染色強度強，點狀結(jié)構(gòu)多。
　　結(jié)論：
　　1、OTX2-siRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞，可以有效下調(diào)細胞內(nèi)OTX2蛋白表達水平。
　　2、OTX2基因表達下調(diào)可以引起MC3T3-E1細胞中S期細胞比例減小，抑制MC3T3