鋅協(xié)同三羥異黃酮對成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松是以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。近年來骨質(zhì)疏松發(fā)病率的逐年增高引起全世界的廣泛關(guān)注。絕經(jīng)后婦女卵巢功能低下，雌激素分泌減少，骨轉(zhuǎn)換亢進，骨吸收大于骨形成，造成骨丟失，產(chǎn)生骨質(zhì)疏松。由于雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的首要病因，故雌激素替代療法是臨床上的一線療法。激素替代療法雖然能夠阻止絕經(jīng)后婦女骨量的丟失，并且提高骨密度，但長期使用有促子宮內(nèi)膜增生、增加冠心病、腦卒中、肺栓塞、

2、乳腺癌等發(fā)生率的危險。由于植物雌激素有雌激素樣作用而沒有雌激素的副作用，因此人們試圖用植物雌激素，如大豆異黃酮等來防治骨質(zhì)疏松。
　　異黃酮由于在結(jié)構(gòu)上與雌激素非常相似，所以其具有類雌激素或抗類雌激素的生理作用，它能夠模擬天然的雌激素，與雌激素受體競爭性結(jié)合，調(diào)節(jié)其活性。因此黃酮類化合物對激素依賴性的癌癥(如前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等)的防治特別有效，并能延緩或減輕中老年婦女絕經(jīng)期的各種癥狀。
　　植物雌激素具有雙重生物活性

3、，既能發(fā)揮促雌激素作用又能發(fā)揮抗雌激素作用，但其機理還不完全清楚。部分體內(nèi)實驗顯示其生物活性是根據(jù)個體內(nèi)源性雌激素含量來調(diào)節(jié)的。長期臨床試驗證明：異黃酮對低雌激素水平者，表現(xiàn)為弱的雌激素樣作用，可防治一些和雌激素水平下降有關(guān)的疾病，如更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、高脂血癥等；對于高雌激素水平者，表現(xiàn)為抗雌激素活性，可防治乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等，可見其對機體具有雙向調(diào)節(jié)平衡功能。攝入大量的大豆制品能使雌激素循環(huán)受抑，并影響絕經(jīng)前婦女的月經(jīng)周期。<

4、br>　　三羥異黃酮作為一種植物雌激素，其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，通過模擬雌激素作用可調(diào)節(jié)骨代謝，促進成骨細(xì)胞增殖和骨形成，并減少去除卵巢后骨量的丟失，產(chǎn)生防治骨質(zhì)疏松的作用。
　　異黃酮防治骨質(zhì)疏松的作用機制仍未完全清楚，但可明確的是ER是作用的關(guān)鍵因素。異黃酮通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞核，與核ER受體結(jié)合，改變其構(gòu)型，形成配基受體復(fù)合物二聚體，這種配基誘導(dǎo)的復(fù)合物與共調(diào)節(jié)蛋白（輔激活子或輔抑制子）結(jié)合，再與特定的DNA序列和亞序列結(jié)合，發(fā)生

5、組織或細(xì)胞特異性的基因表達。異黃酮無論是對骨、膽固醇代謝所表現(xiàn)的雌激素激動劑的效應(yīng)還是在子宮及乳腺組織中所表現(xiàn)的拮抗劑的作用都與ER高親和力的相互作用有關(guān)。雌激素受體有兩種亞型，分別是ERα和ERβ，兩種亞型在人體許多組織和細(xì)胞都有分布，ERα在尿道、乳腺中占主導(dǎo)地位,而ERβ在骨骼、心血管、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，異黃酮和ERα、ERβ結(jié)合，在不同的組織或在不同的生理條件下產(chǎn)生雌激素樣作用或抗雌激素樣作用。其組織選擇性作用的發(fā)

6、揮可由三種相互作用的機制來解釋：靶組織中兩種ER亞型表達的差異；不同配體結(jié)合引起的ER構(gòu)型變化的差異；共調(diào)節(jié)蛋白表達水平的差異及與ER結(jié)合的種類數(shù)量的不同。有文獻報道，骨骼中，異黃酮在生理水平則選擇性作用于ERβ，與其親合力為ERα的20倍。異黃酮促進成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用可能與ERβ激動有關(guān)。
　　鋅是動物機體必需的微量元素，除了參與生長發(fā)育、生殖和免疫等多種生理反應(yīng)外，在骨骼代謝和相關(guān)功能基因表達方面也發(fā)揮重

7、要作用。Relea等認(rèn)為鋅具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞和抑制內(nèi)源性肝素顆粒釋放的作用，而骨源性肝素與骨質(zhì)疏松病理過程有關(guān)。鋅還可以協(xié)同細(xì)胞因子、雌激素等，調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的代謝。Aitken通過對股骨的活檢測定骨鋅的含量，發(fā)現(xiàn)鋅與股骨密度密切相關(guān)。Fushimi等報道糖尿病鼠血鋅比對照組低，24h尿鋅排出量為對照組的3倍，通過檢測分析發(fā)現(xiàn)尿鋅增加與血漿、肝、腎內(nèi)鋅下降無關(guān)，而與骨組織鋅含量減少有顯著關(guān)系?？傊?，骨質(zhì)疏松是一種復(fù)雜的病變過程，而鋅作為微量元

8、素,既是骨的組分，又參與骨的代謝過程，臨床研究發(fā)現(xiàn)血清鋅和尿鋅與骨質(zhì)疏松有相關(guān)性。鋅能夠促進成骨細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞進入DNA合成期，從而促進DNA合成及細(xì)胞增殖。
　　實驗?zāi)康模?br>　　以成骨細(xì)胞MC3T3-E1為研究對象，研究不同劑量三羥異黃酮和鋅單獨、聯(lián)合作用對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響，并通過研究細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）、骨形成蛋白-2（BMP-2）表達的變化，探討鋅和三羥異黃酮對骨質(zhì)疏松的防治

9、作用及其作用機制。
　　實驗方法：
　　細(xì)胞使用α-MEM培養(yǎng)基(含10％滅活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素)，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。根據(jù)實驗?zāi)康模瑢⒓?xì)胞分為以下六組：
　　(1)正常對照組：不加任何處理因素常規(guī)培養(yǎng)；
　　(2)溶劑對照組：培養(yǎng)液中加入DMSO，體積比為0.1％；
　　(3)陽性對照(E2)組：在培養(yǎng)液中加入E2，使終濃

10、度為1×10-9mol/L；
　　(4)Zn組：在培養(yǎng)液中加入Zn，終濃度分別為1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L；
　　(5)GS組：在培養(yǎng)液中加入GS，終濃度分別為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L；
　　(6)GS+Zn組：在GS組各濃度中分別加入終濃度為1×10-5mol/L的Zn。
　　將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)

11、板(2×103個/孔)，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，按實驗分組于每孔加入不同濃度的各種受試物(總體積200μl/孔)，每一劑量組設(shè)8個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h，通過MTT比色實驗，檢測處理因素對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。
　　將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(1×104個/孔)，24h后換含不同濃度受試物的α-MEM培養(yǎng)液。孵育72h后收集所有細(xì)胞，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。按ALP試劑盒操作步驟檢測MC3T3-E1

12、細(xì)胞中ALP的含量。應(yīng)用Western blot法檢測三羥異黃酮與鋅聯(lián)合作用前后，成骨細(xì)胞中BMP-2蛋白的表達水平。
　　實驗結(jié)果：
　　1、三羥異黃酮單獨作用于MC3T3-E1細(xì)胞，其增殖率隨著三羥異黃酮濃度的增加和作用時間的延長而升高，當(dāng)1×10-5mol/L的三羥異黃酮作用細(xì)胞96h時，其增殖率是140.7±21.1％；當(dāng)Zn濃度為1×10-5mol/L時作用細(xì)胞96h，其增殖率最大，為135.9±20.9％；而當(dāng)1

13、×10-5mol/L的三羥異黃酮協(xié)同1×10-5mol/L的鋅作用細(xì)胞96h，其細(xì)胞增殖率大于兩者單獨作用，為160.8±20.9％。
　　2、各干預(yù)因素處理MC3T3-E1細(xì)胞72h后，ALP的活性隨著GS濃度的增加而增強。Gs濃度為1×10-5mol/L時與1×10-5mol/L的Zn單獨作用細(xì)胞時，ALP活性分別是對照組的1.5、1.4倍，而當(dāng)其協(xié)同作用細(xì)胞時，ALP活性是對照組的1.7倍。
　　3、GS和Zn作用于M

14、C3T3-E1細(xì)胞72h后，細(xì)胞中BMP-2蛋白的表達隨著Gs濃度的增加而增強；Gs和Zn協(xié)同作用時BMP-2蛋白的表達比單獨作用時明顯增強。
　　4、三羥異黃酮和鋅聯(lián)合作用后，對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、ALP活性的增強、BMP-2表達的增加作用均較各自單獨作用時更為明顯(P<0.05)。
　　實驗結(jié)論：
　　三羥異黃酮與鋅協(xié)同作用表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)，可通過促進骨形成蛋白的合成從而促進成骨細(xì)胞的增殖、增加骨量。因此，