ClC-3氯通道介導(dǎo)甲狀旁腺激素對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　骨代謝紊亂包括骨形成和骨吸收過程的不調(diào)，骨吸收障礙可導(dǎo)致骨質(zhì)硬化癥，而骨形成不足會引起骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度降低、骨量減少、骨小梁排列紊亂的特點也給其缺牙種植修復(fù)、錯牙合畸形正畸矯治等口腔臨床治療帶來了諸多問題，嚴(yán)重影響著患者的健康和生活質(zhì)量。甲狀旁腺素（PTH）是體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素之一，已有研究表明持續(xù)性給予PTH刺激可造成骨量丟失及骨密度降低，而間斷性給予 PTH刺激可使骨密度及骨強度顯著增高

2、，其具體機制復(fù)雜而不明確。C lC-3氯通道是一類電壓門控型的離子通道，然而 ClC-3基因敲除小鼠表現(xiàn)出生長阻滯及骨發(fā)育的異常，著提示我們 ClC-3氯通道可能與骨發(fā)育和骨代謝有關(guān)。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3氯通道存在于成骨細(xì)胞中，具有增強細(xì)胞體外礦化能力及促進(jìn)成骨分化的作用。既然PTH和C lC-3氯通道在骨代謝過程中都具有促進(jìn)骨形成的作用，那么研究二者在成骨分化過程中是否具有某種內(nèi)在的聯(lián)系就具有重要的意義。
　　研究

3、目的：
　　本研究旨在通過觀察在不同濃度及不同給藥方式的PTH刺激下，MC3T3-E1細(xì)胞中ClC-3氯通道及成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化，并通過干擾C lC-3氯通道的表達(dá)來初步探索成骨細(xì)胞中ClC-3氯通道在P TH的促進(jìn)成骨分化過程中的作用，為P TH在促進(jìn)成骨作用的機制研究提供新的思路。
　　研究內(nèi)容：
　?。?）研究不同濃度及不同給藥方式的PTH刺激對MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力及其成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響。

4、　?。?）研究PTH刺激對MC3T3-E1細(xì)胞中C lC-3氯通道表達(dá)的影響。
　?。?）初步探究ClC-3氯通道在PTH促成骨分化中的作用。
　　研究方法：
　　（1）通過CCK-8試劑盒法檢測不同實驗分組的MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況，同時利用Real-Time PCR法檢測MC3T3-E1細(xì)胞中成骨相關(guān)基因Alp、Runx2的表達(dá)情況。
　　（2）通過Real-Time PCR方法及細(xì)胞免疫熒光法檢測PT

5、H刺激對ClC-3氯通道表達(dá)的影響，初步分析兩者之間的關(guān)系。
　　（3）利用免疫熒光方法檢測不同ClC-3氯通道表達(dá)水平的MC3T3-E1細(xì)胞在PTH刺激下ClC-3氯通道蛋白的變化情況，利用Real-Time PCR檢測各組細(xì)胞中成骨相關(guān)基因及Clcn3的表達(dá)情況，并進(jìn)一步觀察各組細(xì)胞體外礦化能力的變化。
　　研究結(jié)果：
　?。?）10-9 M的PTH間斷刺激下，MC3T3-E1細(xì)胞中Alp、Runx2的表達(dá)最顯著。

6、
　　（2）10-9 M的PTH間斷刺激時，MC3T3-E1細(xì)胞中的C lC-3氯通道表達(dá)量在各實驗組中最強。
　?。?）10-9M的PTH刺激MC3T3-E1細(xì)胞，ClC-3 siRNA干擾組比ClC-3氯通道正常表達(dá)組的成骨相關(guān)基因表達(dá)量明顯降低，同時，體外礦化能力也減弱。
　　結(jié)論：
　　（1）合適濃度的PTH間斷刺激有促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化作用。
　?。?）MC3T3-E1細(xì)胞中的C lC-3氯通道能