反式白藜蘆醇對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的調(diào)控作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分反式白藜蘆醇對去卵巢大鼠骨量的影響及對MC3T3-E1細(xì)胞生長、分化、礦化及凋亡的作用 目的：反式白藜蘆醇是在葡萄皮及紅酒中存在的一種植物雌激素，具有多種生物活性作用。本研究旨在探討反式白藜蘆醇對去卵巢大鼠骨量的影響及在雌激素缺乏狀態(tài)下對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的增殖、分化、礦化及凋亡的作用。 方法：48只SD大鼠隨機(jī)分為6組，分為A組，接受假手術(shù)；B組，接受去卵巢手術(shù)；C組，去卵巢+0.03mg.kgbw-1

2、·d-1己烯雌酚(DES)；D、E、F組，去卵巢+T-Res(分別為5、15和45mg·kgbw-1·d-1T-Res)處理90天，觀察大鼠的骨密度變化。用無酚紅DMEM培基模擬雌激素撤退，于培養(yǎng)液中加入不同濃度的反式白藜蘆醇(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L，及10-5mol/L T-Res)以觀察對小鼠顱骨成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的作用。通過WST-8法反映細(xì)胞DNA合成；測定細(xì)胞內(nèi)堿

3、性磷酸酶活性、NO含量以反映細(xì)胞分化狀況；測定細(xì)胞BGP含量，通過茜素紅染色對礦化結(jié)節(jié)計數(shù)以反映細(xì)胞礦化程度；采用血清饑餓法誘導(dǎo)MC3T3-E1凋亡，通過RT-PCR反映凋亡相關(guān)基因bel-2及bax mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：大鼠去卵巢后總體BMD及腰椎骨密度均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，反式白藜蘆醇各組大鼠全身和腰椎BMD均顯著高于去卵巢手術(shù)組(P<0.05)，45mg.kgbw-1·d-1 T-Res對大鼠骨量的保護(hù)作

4、用最為明顯。10-9～10-6mol/L反式白藜蘆醇可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞DNA合成。此外，10-8～10-5mol/L反式白藜蘆醇可升高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性、一氧化氮含量，骨鈣素水平及礦化結(jié)節(jié)的形成。與血清饑餓組相比較，10-8～10-5mol/L反式白藜蘆醇組的細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(p<0.05)，而bax mRNA表達(dá)顯著下降(p<0.05)。另一方面，10-5mol/L反式白藜蘆醇可抑制MC3T

5、3-E1細(xì)胞的增殖。 結(jié)論：10-8～10-6mol/L反式白藜蘆醇可促進(jìn)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1生長、增殖、分化及礦化，并可抑制血清饑餓法誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。 第二部分反式白藜蘆醇對MC3T3-E1細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制 目的：成骨細(xì)胞在骨代謝中發(fā)揮著重要作用。本研究旨在從雌激素受體及OPG/RANKL兩個途徑來探討反式白藜蘆醇對MC3T3-E1的調(diào)控機(jī)制。 方法：用無酚紅DMEM培基模擬

6、雌激素撤退，于培養(yǎng)液中加入不同濃度的反式白藜蘆醇(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L及10-5mol/L T-Res)以觀察對小鼠顱骨成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的部分基因和蛋白表達(dá)的作用，并加入雌激素受體拮抗劑(ICI182780)以觀察白藜蘆醇的雌激素樣作用。通過RT-PCR技術(shù)檢測ER-α、ER-β、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、護(hù)骨素(OPG)及核因子-кB受

7、體活化子配體(RANKL)mRNA的表達(dá)；通過western blotting技術(shù)檢測測ER-β、OPG及RANKL蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：MC3T3-E1可表達(dá)ER-α與ER-β，ICI182780可抑制雌激素受體的表達(dá)。與對照組比較，10-7-10-5mol/L反式白藜蘆醇可上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中ER-β、TGF-β1及Col-I mRNA表達(dá)(P<0.05)，但對ER-α無明顯作用。在mRNA和蛋白水平，均可觀察到10-7