ClC-3氯通道參與TGF-β-Smads通路調(diào)控甲狀旁腺激素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　骨質(zhì)疏松是臨床上最常見的骨代謝疾病之一，主要表現(xiàn)為疼痛、易骨折，嚴(yán)重者可致呼吸功能下降，顯著影響病患的生活質(zhì)量，因而骨質(zhì)疏松的治療越來越受到人們的關(guān)注。甲狀旁腺的主細(xì)胞能夠分泌PTH，從而來調(diào)控骨組織代謝以及來維持機(jī)體的鈣平衡。然而，PTH能夠雙向地調(diào)節(jié)骨組織的代謝。具體言之，間斷PTH刺激下，小劑量時(shí)能夠促進(jìn)骨組織的形成；持續(xù)PTH刺激下，大劑量則可以促進(jìn)骨組織的吸收。但其具體的作用機(jī)制尚未探明，因而未能應(yīng)用于臨

2、床上骨質(zhì)疏松患者的治療，因此進(jìn)一步闡明PTH促進(jìn)骨形成的機(jī)制將為其應(yīng)用于臨床提供更多的理論依據(jù)。
　　ClC-3電壓門控氯通道存在于成骨譜系細(xì)胞中，在對(duì)成骨細(xì)胞的作用上與 PTH有許多共同點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTH刺激能顯著上調(diào)成骨細(xì)胞中 ClC-3的表達(dá)。并且PTH能通過ClC-3調(diào)節(jié)下游成、破骨相關(guān)基因的表達(dá)，但其分子機(jī)制并不十分明確。有研究認(rèn)為，PTH與TGF-β1在膜受體水平上可相互影響，共同調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成，但其作用機(jī)制

3、非常復(fù)雜還不清楚。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn) ClC-3也參與了成骨細(xì)胞中TGF-β1信號(hào)的調(diào)控，TGF-β可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖與分化，其中TGF-β1通過Smad2/3信號(hào)調(diào)控核心結(jié)合蛋白因子Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨作用。由此可見，ClC-3不僅和PTH在骨代謝的調(diào)節(jié)上有密切關(guān)系，還參與了TGF-β1信號(hào)的調(diào)控。所以，ClC-3如何介導(dǎo)TGF-β1與PTH之間的相互作用關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。本課題旨在研究在PTH間斷刺激下，ClC

4、-3氯通道、TGF-β1及下游信號(hào)分子之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究PTH的促成骨分化作用機(jī)制提供新的思路。
　　研究目的：
　　本研究旨在通過調(diào)節(jié)ClC-3氯通道基因及TGF-β1基因的不同表達(dá)水平來初步探究ClC-3氯通道在PTH調(diào)節(jié)成骨分化過程中的作用機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容：
　?。?）研究在1×10-9 MPTH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞每隔6小時(shí)間斷刺激下，分別下調(diào)TGF-β1和ClC-3基因表達(dá)水平后，觀

5、察兩者基因、蛋白表達(dá)的表達(dá)情況。
　?。?）研究在1×10-9 M PTH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞每隔6小時(shí)間斷刺激下，分別下調(diào)及共同下調(diào)TGF-β1和ClC-3基因表達(dá)水平后，研究其下游成、破骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　（3）研究在1×10-9 M PTH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞每隔6小時(shí)間斷刺激下，分別下調(diào)及共同下調(diào)TGF-β1和ClC-3基因表達(dá)水平后，檢測(cè)成骨細(xì)胞體外礦化能力的變化。研究方法：
　?。?）采用基因轉(zhuǎn)

6、染的方法，分別用特異性siRNA下調(diào)成骨細(xì)胞MC3T3-E1中TGF-β1及ClC-3基因的表達(dá)水平，同時(shí)利用Real-Time PCR檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞中TGF-β1和ClC-3基因表達(dá)水平，成、破骨相關(guān)基因（Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl）表達(dá)水平。
　　（2）通過免疫印跡方法及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)PTH刺激下TGF-β1和ClC-3氯通道蛋白表達(dá)的影響，初步分析兩者之間的關(guān)系。
　?。?）利用

7、茜素紅染色及計(jì)算鈣結(jié)節(jié)觀察成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及PTH刺激培養(yǎng)下各組MC3T3-E1細(xì)胞的體外礦化能力。
　　研究結(jié)果：
　?。?）10-9 M的PTH間斷刺激時(shí)，MC3T3-E1細(xì)胞中僅下調(diào)TGF-β1基因表達(dá)后，ClC-3氯通道基因及蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)；僅下調(diào)ClC-3氯通道基因后，TGF-β1基因及蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)。
　?。?）10-9 M的PTH間斷刺激時(shí)，在分別下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β

8、1基因后，成、破骨相關(guān)基因（Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl）表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低。
　　（3）10-9 M的PTH間斷刺激時(shí)，共同下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因之后，成、破骨相關(guān)基因（Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl）較對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　?。?）10-9 M的PTH間斷刺激時(shí)，成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成骨的能力優(yōu)于PTH刺激，在分別下調(diào)ClC-3氯通道

9、基因和TGF-β1基因表達(dá)水平后，MC3T3-E1細(xì)胞的體外礦化能力較對(duì)照組均下降。在共同下調(diào)兩者之后，其體外礦化能力較對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　研究結(jié)論：
　?。?）在PTH刺激促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中，ClC-3與TGF-β1信號(hào)可相互影響。
　　（2）ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因均可響應(yīng)PTH的間斷刺激而發(fā)生變化，進(jìn)而影響下游成、破骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　?。?）不同表達(dá)水平的ClC-3