氯通道ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨細胞分化中的作用.pdf

1、研究背景：
　　在人的一生中骨總是在不斷的改建與重塑，正畸治療正是利用骨吸收與骨改建的原理治療錯牙合畸形的一門學科，因此對于骨形成與骨改建機理的揭示對于正畸治療理論基礎研究是至關重要的。成骨細胞是參與骨形成及骨改建過程的重要細胞，成骨細胞的增殖、分化及調控是骨形成機理研究的重要內容。研究表明許多因素參與調節(jié)細胞的成骨分化，已發(fā)現(xiàn)有許多離子通道與細胞的成骨分化有關，如Ca2+、K+等，作為體內最主要的陰離子通道——氯通道在成骨分化中

2、的作用還知之甚少。
　　近年來，隨著對氯通道結構的深入認識，和一些與氯通道基因突變相關的人類遺傳性疾病的發(fā)現(xiàn)與研究，氯通道在生物體內的重要作用越來越引起了人們的關注。ClC型氯通道是一大類電壓門控型的氯通道，構成了一個大的基因家族。其中，ClC-3、ClC-4和ClC-5為內體系統(tǒng)的ClC型氯通道，由于其基因序列的高度相似性組成了ClC型氯通道家族的一個分支，主要參與神經(jīng)細胞突觸囊泡和細胞內體的酸化作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)內體系統(tǒng)的

3、ClC型氯通道基因敲除的小鼠表現(xiàn)出生長阻滯及骨發(fā)育的異常，提示我們ClC-3、ClC-4和ClC-5可能與細胞的成骨分化有關。
　　研究目的：
　　本研究目的在于觀察ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在成骨細胞分化過程中的表達變化，從而進一步探求ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨細胞分化中的作用，并初步研究分析其作用機制。
　　研究方法：
　　體外分離、培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓間充質干細胞，原代培養(yǎng)小鼠

4、顱頂骨來源的成骨細胞及小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1，利用RT-PCR方法檢測ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在以上三種成骨譜系細胞中的表達。利用成骨條件培養(yǎng)液對MC3T3-E1細胞進行成骨誘導培養(yǎng)，用RT-PCR及real-timePCR方法檢測細胞成骨誘導過程中ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的表達變化。利用脂質體轉染含ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因全長的質粒，構建瞬時過表達ClC-3、Cl

5、C-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1細胞體系。同樣，利用脂質體轉染ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的干擾siRNA，構建干擾ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表達的MC3T3-E1細胞體系。用RT-PCR及real-timePCR方法檢測兩種基因表達體系中，成骨相關基因的表達變化。在基因過表達體系中，檢測細胞體外礦化能力的變化，并檢測細胞內細胞器的酸堿變化。用細胞免疫熒光方法，利用激光共聚焦顯微鏡對MC3

6、T3-E1細胞中的氯通道及TGF-β1進行定位。分析前期研究結果，進一步對氯通道在成骨分化中的作用機制進行研究。
　　研究結果：
　　RT-PCR結果顯示，在小鼠骨髓間充質干細胞、原代培養(yǎng)小鼠顱頂成骨細胞以及小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1細胞中均有ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的陽性表達。在MC3T3-E1細胞成骨誘導培養(yǎng)中，伴隨成骨相關基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達增強，ClC-3、ClC-4

7、和ClC-5氯通道基因的表達也顯著增強。在過表達ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1細胞中，成骨相關基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達增強，細胞內內體系統(tǒng)的酸化作用加強，細胞體外的礦化能力明顯加強。在干擾了ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表達的MC3T3-E1細胞中，成骨相關基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達顯著降低。在細胞免疫熒光實驗中發(fā)現(xiàn)，ClC-3氯通道定位于細胞內核周圍內體和

8、溶酶體等細胞器。ClC-3與TGF-β1的表達有共定位，且過表達ClC-3基因能明顯下調TGF-β1的表達。在過表達ClC-3基因的MC3T3-E1細胞中，干擾Runx2的基因表達后，成骨相關基因ALP、BSP、OC、Runx2、Osx的表達被明顯抑制。
　　結論：
　　ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道存在于小鼠骨髓間充質干細胞、原代培養(yǎng)小鼠顱頂成骨細胞以及小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1等成骨譜系細胞中。ClC-