周期性動態(tài)壓力對成骨細胞CLC-3離子通道影響的機制研究.pdf

1、骨組織對外界刺激特別敏感，能夠感受到各種化學和力學信號的刺激。成骨細胞的形態(tài)、分化和增殖均與力學刺激有關。當機械外力作用于骨組織時，成骨細胞處于組織的應力環(huán)境中，應力刺激細胞膜并通過微絲和微管傳遞到細胞核，應力信號在傳遞過程中引起一系列生化反應，從而刺激成骨細胞內各種成骨分化相關基因的表達，影響骨的形成及改建。目前有關各種應力環(huán)境下成骨效應的研究雖然較多，但大部分為牽張力及流體剪切力對骨組織或成骨細胞的影響，而壓力對成骨細胞刺激的研究多

2、采用靜態(tài)壓力模式，且為持續(xù)靜態(tài)壓力，關于動態(tài)壓力刺激對骨組織的作用效應較少報導。近年來研究發(fā)現(xiàn)Ca2+、K+、Cl–等離子通道均與成骨細胞的分化有關，其中CLC型氯通道是最重要的一種陰離子通道，它的突變和功能異?？梢鸲喾N疾病。CLC-3型氯通道是電壓門控型氯通道之一，可參與調節(jié)細胞容積、細胞增殖、細胞分化及凋亡等。研究表明CLC-3基因促進成骨細胞分化與Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription fa

3、ctor2, Runx2)有關。轉錄相關因子Runx2是成骨細胞分化的重要因子，它參與多種細胞內外信號的傳遞，其中BMP-2-Smads-Runx2信號通路在外界刺激成骨細胞分化中發(fā)揮重要作用。在成骨細胞分化過程中，多種成骨細胞特異性基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、Runx2、骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)等成骨分化相關基因陸續(xù)表達，分泌到細胞外基質中，調控

4、細胞外基質的礦化，逐步完成機體內骨組織的形成。最近研究發(fā)現(xiàn)一定時間和大小的靜態(tài)壓力刺激能引起成骨細胞內CLC-3表達的增加，并促進成骨細胞的分化，但應用Flexcell細胞加壓系統(tǒng)研究周期性動態(tài)壓力對成骨細胞CLC-3離子通道的影響及其機制尚未見報導。本課題應用Real-time PCR及Western blot等方法分三部分研究周期性動態(tài)壓力對成骨細胞CLC-3的影響及其機制。第一部分：周期性動態(tài)壓力對成骨細胞CLC-3離子通道及成骨

5、分化相關基因表達的影響；第二部分：Chlorotoxin對成骨細胞CLC-3離子通道及成骨分化相關基因加壓后表達的影響；第三部分：周期性動態(tài)壓力對CLC-3離子通道及成骨細胞增殖相關基因表達的影響。
　　第一部分：周期性動態(tài)壓力對成骨細胞CLC-3離子通道及成骨分化相關基因表達的影響
　　目的：觀察周期性動態(tài)壓力對成骨細胞MC3T3-E1超微結構的影響；探討周期性動態(tài)壓力對成骨細胞CLC-3離子通道及成骨分化相關基因BMP-

6、2、Runx2及OPN表達的影響。
　　方法：自中科院上海細胞庫購置小鼠顱頂成骨細胞MC3T3-E1，于12孔板(含有10％FBS及50μg/ml抗壞血酸的培養(yǎng)基)內培養(yǎng)，在第14天時加入2mM的β-甘油磷酸鈉，連續(xù)培養(yǎng)至28天，形成約1-2mm厚的3D細胞膜。將細胞分為實驗組及對照組，實驗組：收集3D細胞膜，并用吸管放入到Biopress培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，每個培養(yǎng)孔加入1.5ml含5％FBS，100U/ml青霉素，100μg/m

7、l鏈霉素和4mM谷氨酰胺的CO2敏感性培養(yǎng)基(Invitrogen公司，法國)。利用生物力學加載系統(tǒng)(Flexcell公司,美國)分別對各培養(yǎng)孔中的細胞膜加載壓力，加力等級為30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形壓力下加載2、4、8h。壓力加載后，取出該3D細胞膜，IV型骨膠原酶消化并分離3D膜中的成骨細胞備用(3mg/ml，37℃條件下攪拌30min)。應用透射電鏡觀察周期性動態(tài)壓力條件下MC3T3-E1細胞超微結構的變化；采用R

8、eal-time PCR法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN mRNA的表達；Western blot方法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN蛋白的表達。對照組：細胞不加壓，余處理同實驗組。
　　結果：經透射電鏡觀察MC3T3-E1細胞，可見加壓前細胞表面少量突起，細胞質內可見少量線粒體、粗面內質網(wǎng)及高爾基體等細胞器。加壓2h后，細胞表面突起輕度增加，線粒體、粗面內質網(wǎng)及高爾基體等細胞質內的細胞器輕度增加。加

9、壓4h后，細胞表面突起明顯增多，核仁變明顯，胞核位于細胞的一側，胞漿中可見散在豐富的溶酶體及糖元，胞核周圍可見較多的粗面內質網(wǎng)、高爾基復合體及散在的橢圓形線粒體。加壓8h后，細胞較加載4h細胞表面突起略有增多，高爾基復合體、粗面內質網(wǎng)和線粒體也進一步增多。
　　對照組2、4、8h后CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN mRNA及蛋白均無明顯變化(P>0.05)。與對照組比較，動態(tài)壓力加載MC3T3-E1細胞2、4、8h后，細

10、胞內CLC-3及成骨分化相關基因BMP-2、Runx2及OPN在mRNA及蛋白水平均明顯上調(P<0.05)。
　　第二部分：Chlorotoxin對成骨細胞CLC-3離子通道及成骨分化相關基因加壓后表達的影響
　　目的：觀察Chlorotoxin(Cltx，CLC-3特異性阻滯劑)阻斷CLC-3離子通道后周期性動態(tài)壓力對MC3T3-E1細胞中CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因表達的影響。
　　方法:

11、>　　3D細胞膜的制備及細胞提取同第一部分。
　　為研究加入Chlorotoxin后，細胞加壓后CLC-3及成骨細胞分化相關基因BMP-2、Runx2及OPN的表達變化，我們將實驗分為兩組。
　　1、實驗組一：細胞加壓且不加Cltx組。
　　MC3T3-E1細胞經過30Kpa，頻率為1Hz，1/2正弦波形的動態(tài)壓力8h后，取出3D細胞膜，IV型骨膠原酶消化并分離3D細胞膜中的細胞，應用Real-time PCR及Wes

12、tern blot方法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因mRNA及蛋白的表達。
　　2、實驗組二：細胞加壓且加入Cltx組。
　　細胞加壓前30分鐘應用Cltx阻斷CLC-3離子通道，然后給予加力等級為30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形動態(tài)壓力培養(yǎng)MC3T3-E1細胞8h后， Real-time PCR及Western blot方法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因mRNA及蛋白的表達

13、。
　　結果：與加壓不加Cltx組比較，應用Cltx阻斷CLC-3離子通道周期性動態(tài)壓力條件下培養(yǎng)MC3T3-E1細胞8h后，CLC-3 mRNA和蛋白的表達無明顯降低(P>0.05)，而BMP-2、Runx2及OPN基因mRNA和蛋白的表達均明顯下降，結果有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　第三部分：周期性動態(tài)壓力對CLC-3離子通道及成骨細胞增殖相關基因表達的影響
　　目的：檢測成骨細胞MC3T3-E1經過不同時間

14、周期性動態(tài)壓力作用后細胞內CLC-3離子通道及增殖相關基因PCNA及Ki67 mRNA及蛋白的表達，并探討其相關性。
　　方法：3D細胞膜的制備及細胞提取同第一、二部分。將細胞分為實驗組及對照組，實驗組：收集3D細胞膜，并用吸管放入到Biopress培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，每個培養(yǎng)孔加入1.5ml含5％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和4mM谷氨酰胺的CO2敏感性培養(yǎng)基(Invitrogen公司，法國)。利用生物力學

15、加載系統(tǒng)(Flexcell公司,美國)分別對各培養(yǎng)孔中的細胞膜加載壓力，加力等級為30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形壓力下加載2、4、8h。壓力加載后，取出3D細胞膜，IV型骨膠原酶消化并分離3D膜中的成骨細胞(3mg/ml，37℃條件下攪拌30min)。Real-time PCR檢測CLC-3及增殖相關基因PCNA及Ki67 mRNA的表達，Western blot法檢測CLC-3、PCNA及Ki67蛋白的表達。對照組：細胞不

16、加壓，余處理同實驗組。
　　結果：對照組2、4、8h后CLC-3、Ki67及PCNA mRNA及蛋白均無明顯變化(P>0.05)。與對照組比較，動態(tài)壓力作用于成骨細胞MC3T3-E1細胞2、4、8h后CLC-3基因在mRNA及蛋白水平表達均明顯增加(P<0.05)，成骨細胞增殖相關基因PCNA及Ki67在mRNA及蛋白水平上無明顯變化(P>0.05)。
　　結論：
　　1、周期性動態(tài)壓力可促進CLC-3表達，增加細胞膜

17、表面CLC-3離子通道的數(shù)量。
　　2、伴隨CLC-3表達的增加，BMP-2，Runx2及OPN的表達也相應增加，成骨細胞分化可能與CLC-3型氯通道有關。
　　3、周期性動態(tài)壓力可上調成骨細胞分化相關基因BMP-2、Runx2及OPN的表達，促進成骨細胞的分化。
　　4、 CLC-3離子通道特異性阻滯劑Cltx不影響成骨細胞CLC-3基因的表達，但可減少有功能的CLC-3離子通道的數(shù)量。
　　5、 CLC-3基

18、因促進成骨細胞分化是通過有功能的CLC-3離子通道實現(xiàn)的。
　　6、成骨分化相關基因BMP-2、Runx2及OPN的表達與有功能的CLC-3離子通道數(shù)量有關。
　　7、在30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形動態(tài)壓力下加壓2、4、8h后對成骨細胞的增殖活性無明顯影響。
　　8、在30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形動態(tài)壓力下加壓2、4、8h后，CLC-3基因的表達與成骨細胞增殖相關基因Ki67及PCNA無明顯