種植體微納米形貌對(duì)成骨細(xì)胞行為影響的分子機(jī)制研究.pdf

1、純鈦表面微納米形貌能夠很好地模擬人體骨組織和細(xì)胞外微環(huán)境的結(jié)構(gòu),因此可能具有更好成骨細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng),但材料形貌對(duì)細(xì)胞調(diào)控的具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用酸蝕和陽極氧化的方法,在純鈦表面構(gòu)建微納米形貌,以人成骨肉瘤細(xì)胞系 MG63為研究對(duì)象,全面系統(tǒng)評(píng)價(jià)了微納米形貌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并采用分子生物學(xué)方法,深入研究參與材料形貌調(diào)控細(xì)胞行為的信號(hào)通路途經(jīng),以闡明骨植入材料的表面形貌對(duì)骨組織形成的影響的分子生物學(xué)機(jī)制。本研究的方法及

2、結(jié)果不僅為骨植入材料的表面結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計(jì)及基因修飾提供依據(jù)以達(dá)到提高骨植入材料的骨結(jié)合效率的目的,而且將為探明其它材料表面因素如表面化學(xué)成分或其它骨植入材料與細(xì)胞及組織相互作用的分子機(jī)制研究提供參考,從而更加全面指導(dǎo)骨植入材料的表面設(shè)計(jì)。
　　第一部分純鈦表面微納米形貌的制備
　　【目的】采用課題組前期實(shí)驗(yàn)中已建立的純鈦表面微納米形貌的制備方案,制備含有不同管徑TiO2納米管的微納米復(fù)合梯度形貌,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供研究模型。<

3、br>　　【方法】將純鈦試樣拋光至鏡面,采用5％的氫氟酸酸蝕試樣30min,試樣超聲清洗后,采用穩(wěn)壓直流陽極氧化電源在5V和20V兩個(gè)電壓下分別對(duì)試樣進(jìn)行陽極氧化處理1h,采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察試樣表面形貌。
　　【結(jié)果】純鈦表面經(jīng)酸蝕和陽極氧化處理后形成微米坑表面復(fù)合不同管徑TiO2納米管的微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)。TiO2納米管管徑的大小與陽極氧化電壓成正比,5V和20V電壓下分別形成管徑約為30nm和100nm的納米管陣列。
　

4、　【結(jié)論】酸蝕和陽極氧化方法能夠在純鈦表面形成微米坑復(fù)合不同管徑TiO2納米管的微納米形貌。
　　第二部分微納米形貌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　【目的】評(píng)價(jià)微納米形貌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　【方法】將人骨肉瘤細(xì)胞系 MG63細(xì)胞接種于材料表面,采用掃描電鏡觀察試樣表面細(xì)胞的伸展形態(tài),MTT方法觀察細(xì)胞增殖水平,實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞在材料表面成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平,采用天狼星紅染色觀察試樣表面成骨細(xì)胞

5、的膠原分泌能力,采用茜蘇紅染色觀察材料表面成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力。
　　【結(jié)果】成骨細(xì)胞MG63在微納米表面充分伸展,細(xì)胞隨著TiO2納米管管徑的增大而呈現(xiàn)逐漸伸長(zhǎng)的形態(tài)。微納米形貌對(duì)細(xì)胞的增殖沒有顯著性影響,在30nm管徑納米管表面,增殖能力稍有下降。微納米形貌顯著上調(diào)了細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平,促進(jìn)了成骨細(xì)胞的膠原分泌能力和細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力,并且這種促進(jìn)作用在含有100nm納米管的微納米形貌表面更加明顯。
　　

6、【結(jié)論】微納米形貌能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞 MG63的成骨分化功能,含有大管徑納米管(100nm)的微納米形貌對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用更加明顯。
　　第三部分微納米形貌表面Wnt/b-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響
　　【目的】檢測(cè) Wnt/b-catenin信號(hào)通路是否參與材料對(duì)細(xì)胞行為的影響,評(píng)價(jià)Wnt/b-catenin信號(hào)通路在微納米形貌調(diào)控成骨細(xì)胞功能中的作用。
　　【方法】將 MG63細(xì)胞接種于材料表面,采用實(shí)

7、時(shí)定量 PCR方法檢測(cè)試樣表面MG63細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路中受體、激活因子和抑制因子的表達(dá)水平,采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)b-catenin水平;將外源性Wnt信號(hào)通路激活劑Wnt3a和抑制劑Dkk1分別加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,隨后采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)b-catenin水平,并采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)試樣表面成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平,采用商業(yè)試劑盒檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)水平,采用天狼星紅染色檢測(cè)成骨細(xì)胞

8、膠原分泌能力的變化,采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。
　　【結(jié)果】微納米形貌上調(diào)了Wnt信號(hào)通路受體--低密度脂蛋白相關(guān)蛋白6(LRP6)和Wnt信號(hào)通路激活劑Wnt3a的表達(dá),下調(diào)了Wnt通路抑制因子Dkk1/2和分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白1/2(sFRP1/2)的表達(dá),Wnt/b-catenin信號(hào)在微納米形貌表面被激活。在光滑表面加入外源性Wnt信號(hào)激活劑Wnt3a上調(diào)Wnt/b-catenin

9、信號(hào)活性后,成骨分化相關(guān)指標(biāo)如:成骨基因的表達(dá)、堿性磷酸酶水平和膠原分泌能力都隨之增高。在微納米形貌表面加入外源性 Wnt信號(hào)抑制劑 Dkk1后,微納米表面原本增高的Wnt/b-catenin活性受到明顯的抑制,成骨分化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平也隨之受到明顯的抑制。材料表面改變Wnt/b-catenin信號(hào)活性后對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡沒有明顯的影響。
　　【結(jié)論】微納米形貌通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路中Wnt因子的表達(dá),激活Wnt/b-cateni

10、n信號(hào)活性,被激活的Wnt/b-catenin信號(hào)促進(jìn)了成骨細(xì)胞在微納米形貌表面的成骨分化。
　　第四部分微納米形貌表面ILK/b-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響
　　【目的】檢測(cè)整合素連接酶/b-catenin(ILK/b-catenin)信號(hào)通路在微納米形貌調(diào)控成骨細(xì)胞生物學(xué)行為過程中的作用。
　　【方法】將MG63細(xì)胞接種于試樣表面,采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)b-catenin、ILK、整合素b1和b3亞

11、基的表達(dá)水平,采用western blot方法檢測(cè)胞漿和胞核內(nèi)b-catenin、胞漿內(nèi)磷酸化糖原合成激酶3b(p-GSK3b)和 ILK的表達(dá)水平;采用小干擾 RNA轉(zhuǎn)染方法沉默 ILK的表達(dá)后,檢測(cè)試樣表面細(xì)胞成骨基因表達(dá)水平的改變、膠原分泌能力和細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平的變化,并再一次采用western blot檢測(cè)胞漿和胞核內(nèi)b-catenin、胞漿內(nèi)GSK3b和p-GSK3b表達(dá)水平的變化。
　　【結(jié)果】微納米形貌促進(jìn)了整合素

12、b1和b3亞基和ILK的表達(dá)。在微納米表面高表達(dá)的ILK一方面通過促進(jìn)b-catenin mRNA的表達(dá),另一方面通過磷酸化GSK3b進(jìn)而抑制b-catenin在胞漿內(nèi)的降解,兩方面共同作用激活了b-catenin信號(hào)活性。采用小干擾RNA下調(diào)ILK表達(dá)后,微納米形貌表面的成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平、膠原分泌能力和細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平也隨之顯著下降。
　　【結(jié)論】ILK/b-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控微納米形貌對(duì)成骨分化功能的影響。

13、
　　第五部分微納米形貌表面ILK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響
　　【目的】檢測(cè)整合素連接酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ILK/ERK1/2)信號(hào)通路在微納米形貌調(diào)控成骨細(xì)胞生物學(xué)行為過程中的作用。
　　【方法】將 MG63細(xì)胞接種到材料表面,采用 western blot方法檢測(cè)試樣表面總ERK1/2、磷酸化ERK1/2和ILK的表達(dá)水平;采用小干擾RNA轉(zhuǎn)染的方法沉默ILK表達(dá)后,再次采用western

14、blot檢測(cè)試樣表面總ERK1/2和磷酸化ERK1/2表達(dá)水平的變化。將ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中處理細(xì)胞后,采用MTT方法檢測(cè)試樣表面細(xì)胞增殖能力的變化,采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平的變化,采用商業(yè)試劑盒染色檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶分泌水平的變化,采用天狼星紅染色檢測(cè)細(xì)胞膠原分泌能力的變化,采用茜蘇紅染色檢測(cè)成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平的變化。
　　【結(jié)果】微納米形貌顯著性上調(diào)了