多壁碳納米管對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化的影響.pdf

1、碳納米管(carbon nanotubes， CNTs)具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物特性，使其在骨組織修復(fù)材料的應(yīng)用中得到廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)材料之一。有關(guān)CNTs的細(xì)胞毒理學(xué)研究還不夠深入，已公開(kāi)報(bào)道的研究結(jié)果也存在著極大的爭(zhēng)議。一些研究結(jié)果顯示CNTs可引起一系列與細(xì)胞代謝有關(guān)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期間歇、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)發(fā)生。體外骨組織細(xì)胞生物兼容性的研究是CNTs在骨組織工程的發(fā)展和骨組織工程材料的應(yīng)用研究中亟待解決的關(guān)

2、鍵科學(xué)問(wèn)題之一。本文結(jié)合CNTs毒理學(xué)研究新進(jìn)展，以成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞株作為模型細(xì)胞，考察兩種不同長(zhǎng)度的多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖與分化的影響并探討其機(jī)制。具體如下：
　　 采用混合酸化的方法純化MWCNTs，得到分散性良好的MWCNTs懸液；用多步超聲過(guò)濾的方法分離出兩種不同長(zhǎng)度MWCNTs，并用Image J圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)分析

3、MWCNTs長(zhǎng)度分布。結(jié)果表明，短的MWCNTs(short multi-walled carbon nanotubes， S-MWCNTs)的平均長(zhǎng)度約為161nm，長(zhǎng)的MWCNTs(long multi-walled carbon nanotubes， L-MWCNTs)的平均長(zhǎng)度約為681nm;用透射電鏡(transmission electron microscope， TEM)、X射線(xiàn)光電能譜(X-ray photoelect

4、ron spectroscopy, XPS)、熱重分析儀(thermo gravimetric analyzer, TGA)對(duì)兩種不同長(zhǎng)度的MWCNTs進(jìn)行理化表征分析。結(jié)果表明，兩種長(zhǎng)度的MWCNTs均具備良好的分散性、管徑均一，MWCNTs表面獲得親水性羧基基團(tuán)。
　　 MC3T3-E1成骨細(xì)胞暴露于兩種不同長(zhǎng)度的MWCNTs，用WST-1比色分析法測(cè)定MWCNTs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的毒性效應(yīng)；碘化丙啶(propidiu

5、m iodide， PD單染結(jié)合流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；吖啶橙/溴化乙錠(acridine orange/ethidium bromide， AO/EB)雙染進(jìn)行細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀(guān)察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種不同長(zhǎng)度的MWCNTs均可對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生劑量依賴(lài)性的毒性效應(yīng)，且100μg/mL MWCNTs作用MC3T3-E1細(xì)胞24h細(xì)胞活性與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性抑制；FCM分析顯示100μg

6、/mL MWCNTs作用細(xì)胞24h，與對(duì)照組相比，MWCNTs處理后，MC3T3-E1細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡峰(sub-G1峰)；AO/EB染色結(jié)果從細(xì)胞形態(tài)上進(jìn)一步驗(yàn)證了MWCNTs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)。上述結(jié)果表明MWCNTs可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用而導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。
　　 利用異硫氰酸酯(fluorescin isothiocyanate， FITC)-BSA標(biāo)記MWCNTs，結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡(c

7、onfocal laser scanning microscopy， CLSM)觀(guān)察了兩種不同長(zhǎng)度的MWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的分布與定位情況；利用FCM側(cè)向角散射光特性，定量分析MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)MWCNTs的攝取率；利用熒光顯微鏡與掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀(guān)察不同長(zhǎng)度的MWCNTs對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞粘附的影響。CLSM觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，兩種長(zhǎng)度的MWCNTs均在胞漿中聚集；FCM分

8、析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞攝取MWCNTs呈濃度依賴(lài)性，但無(wú)長(zhǎng)度依賴(lài)性；100μg/mLMWCNTs處理細(xì)胞24h，細(xì)胞粘附數(shù)量降低20±0.5％(L-MWCNTs)、23±1.2%(S-MWCNTs)，與對(duì)照組相比，出現(xiàn)顯著差異(p＜0.05);SEM觀(guān)察表明MWCNTs處理后MC3T3-E1細(xì)胞皺縮。上述結(jié)果表明MWCNTs作用于MC3T3-E1細(xì)胞，MWCNTs聚集在細(xì)胞表面與細(xì)胞內(nèi)部可能導(dǎo)致細(xì)胞的粘附能力降低。
　　 利用對(duì)硝基磷酸苯酚

9、二鈉(pNPP)法與茜素紅染色(alizarin red staining， ARS)法檢測(cè)MWCNTs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性與礦化結(jié)節(jié)形成的成骨分化功能的影響。利用羅丹明熒光素-鬼筆環(huán)肽(rhodamine phalloidin)與FITC標(biāo)記的抗α-tubulin二抗，結(jié)合CLSM觀(guān)察MWCNTs對(duì)細(xì)胞骨架F-actin與α-tubulin的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MWC

10、NTs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞功能的影響呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性，但是不表現(xiàn)長(zhǎng)度依賴(lài)性的毒性效應(yīng)，其機(jī)制與MWCNTs導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組抑制有關(guān)。
　　 結(jié)論：結(jié)果表明，S-MWCNTs與L-MWCNTs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性抑制均表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性，細(xì)胞凋亡是誘導(dǎo)細(xì)胞活性降低的可能機(jī)制；兩種長(zhǎng)度的MWCNTs均在細(xì)胞表面有不同程度的聚集，細(xì)胞內(nèi)部的MWCNTs主要集中在胞漿中，且無(wú)明顯的長(zhǎng)度依賴(lài)性，細(xì)胞與MWCNTs的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞