多壁碳納米管對成骨細胞增殖及分化的影響.pdf

1、碳納米管(carbon nanotubes， CNTs)具有獨特的物理、化學和生物特性，使其在骨組織修復(fù)材料的應(yīng)用中得到廣泛關(guān)注的熱點材料之一。有關(guān)CNTs的細胞毒理學研究還不夠深入，已公開報道的研究結(jié)果也存在著極大的爭議。一些研究結(jié)果顯示CNTs可引起一系列與細胞代謝有關(guān)的細胞凋亡、細胞周期間歇、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)發(fā)生。體外骨組織細胞生物兼容性的研究是CNTs在骨組織工程的發(fā)展和骨組織工程材料的應(yīng)用研究中亟待解決的關(guān)

2、鍵科學問題之一。本文結(jié)合CNTs毒理學研究新進展，以成骨細胞MC3T3-E1細胞株作為模型細胞，考察兩種不同長度的多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)對MC3T3-E1細胞增殖與分化的影響并探討其機制。具體如下：
　　 采用混合酸化的方法純化MWCNTs，得到分散性良好的MWCNTs懸液；用多步超聲過濾的方法分離出兩種不同長度MWCNTs，并用Image J圖像處理軟件統(tǒng)計分析

3、MWCNTs長度分布。結(jié)果表明，短的MWCNTs(short multi-walled carbon nanotubes， S-MWCNTs)的平均長度約為161nm，長的MWCNTs(long multi-walled carbon nanotubes， L-MWCNTs)的平均長度約為681nm;用透射電鏡(transmission electron microscope， TEM)、X射線光電能譜(X-ray photoelect

4、ron spectroscopy, XPS)、熱重分析儀(thermo gravimetric analyzer, TGA)對兩種不同長度的MWCNTs進行理化表征分析。結(jié)果表明，兩種長度的MWCNTs均具備良好的分散性、管徑均一，MWCNTs表面獲得親水性羧基基團。
　　 MC3T3-E1成骨細胞暴露于兩種不同長度的MWCNTs，用WST-1比色分析法測定MWCNTs對MC3T3-E1細胞的毒性效應(yīng)；碘化丙啶(propidiu

5、m iodide， PD單染結(jié)合流式細胞儀(flow cytometry, FCM)檢測細胞凋亡率；吖啶橙/溴化乙錠(acridine orange/ethidium bromide， AO/EB)雙染進行細胞凋亡形態(tài)學觀察。實驗結(jié)果表明，兩種不同長度的MWCNTs均可對MC3T3-E1細胞產(chǎn)生劑量依賴性的毒性效應(yīng)，且100μg/mL MWCNTs作用MC3T3-E1細胞24h細胞活性與對照組相比出現(xiàn)顯著性抑制；FCM分析顯示100μg

6、/mL MWCNTs作用細胞24h，與對照組相比，MWCNTs處理后，MC3T3-E1細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡峰(sub-G1峰)；AO/EB染色結(jié)果從細胞形態(tài)上進一步驗證了MWCNTs對MC3T3-E1細胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)。上述結(jié)果表明MWCNTs可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡作用而導(dǎo)致細胞活性降低。
　　 利用異硫氰酸酯(fluorescin isothiocyanate， FITC)-BSA標記MWCNTs，結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡(c

7、onfocal laser scanning microscopy， CLSM)觀察了兩種不同長度的MWCNTs在細胞內(nèi)的分布與定位情況；利用FCM側(cè)向角散射光特性，定量分析MC3T3-E1細胞對MWCNTs的攝取率；利用熒光顯微鏡與掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察不同長度的MWCNTs對MC3T3-E1成骨細胞粘附的影響。CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，兩種長度的MWCNTs均在胞漿中聚集；FCM分

8、析發(fā)現(xiàn)細胞攝取MWCNTs呈濃度依賴性，但無長度依賴性；100μg/mLMWCNTs處理細胞24h，細胞粘附數(shù)量降低20±0.5％(L-MWCNTs)、23±1.2%(S-MWCNTs)，與對照組相比，出現(xiàn)顯著差異(p＜0.05);SEM觀察表明MWCNTs處理后MC3T3-E1細胞皺縮。上述結(jié)果表明MWCNTs作用于MC3T3-E1細胞，MWCNTs聚集在細胞表面與細胞內(nèi)部可能導(dǎo)致細胞的粘附能力降低。
　　 利用對硝基磷酸苯酚

9、二鈉(pNPP)法與茜素紅染色(alizarin red staining， ARS)法檢測MWCNTs對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性與礦化結(jié)節(jié)形成的成骨分化功能的影響。利用羅丹明熒光素-鬼筆環(huán)肽(rhodamine phalloidin)與FITC標記的抗α-tubulin二抗，結(jié)合CLSM觀察MWCNTs對細胞骨架F-actin與α-tubulin的影響。實驗結(jié)果表明MWC

10、NTs對MC3T3-E1細胞功能的影響呈濃度與時間依賴性，但是不表現(xiàn)長度依賴性的毒性效應(yīng)，其機制與MWCNTs導(dǎo)致細胞骨架重組抑制有關(guān)。
　　 結(jié)論：結(jié)果表明，S-MWCNTs與L-MWCNTs對MC3T3-E1細胞活性抑制均表現(xiàn)為濃度依賴性，細胞凋亡是誘導(dǎo)細胞活性降低的可能機制；兩種長度的MWCNTs均在細胞表面有不同程度的聚集，細胞內(nèi)部的MWCNTs主要集中在胞漿中，且無明顯的長度依賴性，細胞與MWCNTs的相互作用導(dǎo)致細胞