牙髓卟啉單胞菌內(nèi)毒素對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、目的：
　　 牙髓卟啉單胞菌(Forphyromomanus endodontalis,P.e)是牙髓根尖周病感染根管中的優(yōu)勢菌,為革蘭陰性厭氧菌,其細(xì)胞壁外膜上的內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides,LPS)是重要的毒力因子。在根尖周病的骨組織病變中,成骨細(xì)胞作用關(guān)鍵,既可分泌礦化基質(zhì)形成骨組織,又可分泌炎癥因子,促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用。本實驗旨在觀察P.e-LPS對成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(alkalinepho

2、sphatase,ALP)活性和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)分泌情況的影響,探討P.e-LPS在成骨細(xì)胞增殖與分化過程中的作用。
　　 材料與方法
　　 1、細(xì)菌培養(yǎng)
　　 應(yīng)用腦心浸液(Brain heart infusion,BHI)固體培養(yǎng)基在37℃、厭氧條件(含80％N2、10％CO2、10％H2)下復(fù)蘇培養(yǎng)P.e,BHI液體培養(yǎng)基增菌后收集細(xì)菌,-20℃保存。
　　 2、內(nèi)

3、毒素提取
　　 采用熱酚水法提取P.e-LPS,應(yīng)用凝膠鱟試劑法對所提取內(nèi)毒素進(jìn)行定性分析。
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小鼠成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)生長于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的MEM-α培養(yǎng)基中,置于含5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長狀態(tài)良好的第3、4代細(xì)胞用于實驗。
　　 4、細(xì)胞增殖率檢測
　　 將終濃度為10、25、50μg/m

4、l的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72h,并設(shè)置未加P.e-LPS的對照組,MTT法于490nm波長處檢測OD值。
　　 5、ALP活性測定
　　 將終濃度為10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1細(xì)胞6、12、24和48h,并設(shè)置未加P.e-LPS的對照組,ALP試劑盒于520nm波長處測OD值。
　　 6、ELISA法檢測IL-6
　　

5、 將終濃度為10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1細(xì)胞48h；根據(jù)劑量組結(jié)果,選擇最佳濃度P.e-LPS作用細(xì)胞6、12、24、48h,并設(shè)置未加P.e-LPS組做對照,ELISA試劑盒于450nm波長處檢測OD值。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行單因素方差分析和Dunnett-t檢驗。顯著水平:P<0.05時有顯著性差異,P<0.01時有高

6、度顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、P.e-LPS作用于MC3T3-E1細(xì)胞,72h時25μg/ml組細(xì)胞相對增殖率(Relativegrowth rate,RGR)為87.464％,低于對照組(P<0.05),50μg/ml組RGR顯著為71.117％,顯著低于對照組(P<0.01)。
　　 2、P.e-LPS作用6h時,各濃度的ALP活性的下降水平與對照組無顯著性差異。當(dāng)P.e-LPS作用12h時,50μ

7、g/ml組ALP活性下降與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。P.e-LPS作用24h后,各濃度組ALP活性均下降(P<0.05)。
　　 3、作用48h時,與0μg/ml組比較,10、25和50μg/ml組IL-6的分泌量均顯著增加(P<0.01),但50μg/ml組IL-6分泌量少于25μg/ml組。將25μg/ml組作用于MC3T3-E1后,與對照組相比較,在6h時IL-6表達(dá)有所增加(P<0.05),隨著作用時間延長,I