不同強(qiáng)度張應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞分化和MAPK磷酸化的影響.pdf

1、目的： 1.非骨水泥假體的遠(yuǎn)期穩(wěn)定性取決于成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨—假體界面的骨長(zhǎng)入。機(jī)械應(yīng)力的大小影響成骨細(xì)胞的功能活性，然而假體周圍的應(yīng)變強(qiáng)度根本不同于成骨細(xì)胞所受的應(yīng)變載荷。由于活體骨組織中單個(gè)細(xì)胞所受的應(yīng)變強(qiáng)度目前無(wú)法直接測(cè)量，因此，為探討關(guān)節(jié)置換術(shù)后成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的應(yīng)答，首先要設(shè)法評(píng)估骨—假體界面成骨細(xì)胞所受機(jī)械應(yīng)變的強(qiáng)度。 2.堿性磷酸酶活性、骨鈣素、Cbfa1/Runx2和I型膠原的表達(dá)被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化和功

2、能的標(biāo)志，因而本研究著眼于探討不同強(qiáng)度的應(yīng)變對(duì)上述基因表達(dá)的影響。 3.機(jī)械刺激選擇性的激活MAPKs信號(hào)通路。拋開(kāi)細(xì)胞類型和機(jī)械刺激方式的差異不談，MAPKs信號(hào)通路的激活還依賴于許多其他的調(diào)節(jié)因素。本研究著眼于探討不同強(qiáng)度的應(yīng)變對(duì)成骨細(xì)胞MAPKs磷酸化的影響及其磷酸化水平對(duì)機(jī)械刺激下成骨細(xì)胞合成I型膠原的影響。 4.大多情況下，由應(yīng)力遮擋引發(fā)的骨丟失并不是導(dǎo)致關(guān)節(jié)置換失敗的唯一因素，但其對(duì)股骨假體穩(wěn)定性的負(fù)面影響卻

3、是不可否認(rèn)的。本研究在細(xì)胞水平探討股骨假體近端不同強(qiáng)度的應(yīng)力遮擋對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法： 1.利用有限元軟件ANSTYS5.5，對(duì)完整股骨和THR有限元模型進(jìn)行股骨近端和股骨-假體界面的應(yīng)力分析。根據(jù)有限元分析數(shù)據(jù)和細(xì)胞水平應(yīng)力擴(kuò)增理論，間接計(jì)算評(píng)估細(xì)胞水平應(yīng)變的強(qiáng)度。 2.分別以0.8％、1.6％、2.4％和3.2％的強(qiáng)度在體外對(duì)人成骨細(xì)胞連續(xù)48h施加1 Hz的牽張應(yīng)力，采用pNPP定量法測(cè)定堿性

4、磷酸酶的活性；利用RT-PCR法半定量測(cè)定骨鈣素、Cbfa1/Runx2和I型膠原的表達(dá)。 3.ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中前膠原羧基端肽(PICP)的濃度；利用Western-Blot法測(cè)定ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平；利用U0126阻斷ERK1/2磷酸化，比較I型膠原的mRNA表達(dá)和培養(yǎng)液中PICP的濃度的變化。 4.在體外分組模擬應(yīng)力遮擋的細(xì)胞力學(xué)環(huán)境，A組應(yīng)變保持不變(對(duì)照組)、B-E組應(yīng)力遮擋分

5、別為25％、50％、75％和100％。利用噻唑藍(lán)法測(cè)定成骨細(xì)胞相對(duì)活性：流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡百分比。 結(jié)果： 1.完整股骨近端的應(yīng)變?yōu)?15±57με，假體置換后的股骨近端的應(yīng)變?yōu)?20±38με。股骨-假體界面的應(yīng)變由近端向遠(yuǎn)端逐漸增高，波動(dòng)于375～1583με之間。根據(jù)細(xì)胞水平應(yīng)變擴(kuò)增模型，上述組織應(yīng)變傳遞至細(xì)胞水平將擴(kuò)增20倍。 2.成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的提高出現(xiàn)在0.8％和1

6、.6％的應(yīng)變水平；2.4％和3.2％的應(yīng)變促進(jìn)骨鈣素的表達(dá)；3.2％的應(yīng)變?cè)鰪?qiáng)Cbfa1/Runx2的表達(dá)；與靜力對(duì)照相比，所有應(yīng)變組I型膠原基因的表達(dá)增強(qiáng)；與1.6％應(yīng)變組相比，I型膠原mRNA水平在0.8％時(shí)減弱，在3.2％時(shí)增強(qiáng)。PICP的濃度增高僅僅出現(xiàn)在2.4％和3.2％的應(yīng)變水平(P<0.05)。 3.成骨細(xì)胞中ERK的磷酸化水平依賴于所受應(yīng)變的強(qiáng)度，隨所受應(yīng)變強(qiáng)度的增加而逐漸增高，而p38和JNK的磷酸化水平未受影

7、響。加入U(xiǎn)0126后，原有的應(yīng)變刺激I型膠原表達(dá)和PICP合成釋放的效應(yīng)完全被阻斷。 4.C、D和E組成骨細(xì)胞的相對(duì)活性明顯降低，分別為0.72±0.09、0.68±0.11和0.76±0.15，與對(duì)照組(0.92±0.13)相比差異有顯著性(P<0.05)；D組和E組成骨細(xì)胞增殖指數(shù)降低至47.87±6.58和51.65±7.71，與對(duì)照組(64.31±7.92)相比差異有顯著性(P<0.05)；C組和D組成骨細(xì)胞凋亡的百分比

8、與對(duì)照組(7.36±0.59)相比差異有顯著性(P<0.05)，分別增高至18.76±2.82和16.78±1.69。B組成骨細(xì)胞的相對(duì)活性、增殖指數(shù)和凋亡百分比與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 結(jié)論： 1.較高強(qiáng)度的應(yīng)變促進(jìn)與基質(zhì)成熟相關(guān)的基因的表達(dá)，而低強(qiáng)度的應(yīng)變刺激堿性磷酸酶活性的提高。I型膠原基因表達(dá)對(duì)張應(yīng)力的應(yīng)答呈強(qiáng)度依賴性。 2.ERK1/2的磷酸化對(duì)張應(yīng)力的應(yīng)答呈強(qiáng)度依賴性。I型膠原的合成