二磷酸鹽對成骨細胞增殖及分化成熟的實驗研究.pdf

1、研究背景:二磷酸鹽問世至今已經(jīng)有近140年的歷史,是一種人工合成的,代謝穩(wěn)定的無機焦磷酸鹽類似物.它由焦磷酸鹽中的P-O-P鍵被不水解的P-c-P鍵代替而形成.P-O-P和P-c-P的分子構型決定了其三維結構能與Ca<'2+>等二價離子結合,這是二磷酸鹽骨靶向作用特性的基礎.目前,二磷酸鹽已經(jīng)發(fā)展到第三代,廣泛應用于骨吸收增加性疾病(如:骨質疏松、瘤源性骨病、Paget病等、高鈣血癥等)的治療,尤其是骨質疏松和骨腫瘤的治療. 二

2、磷酸鹽一般分為兩類:非含氮類二磷酸鹽和含氮類二磷酸鹽.非含氮類二磷酸鹽在體內(nèi)代謝成不水解的ATP類似物,這些具有細胞毒性的ATP類似物在細胞內(nèi)積聚,抑制破骨細胞功能,誘導其凋亡.含氮類二磷酸鹽則通過抑制細胞內(nèi)甲羥戊酸途徑發(fā)揮作用,其機制是選擇性抑制焦磷酸法呢酯合成酶,引起焦磷酸法呢酯(FPP)和焦磷酸二牛龍牛兒酯((3GPP)合成減少,從而阻礙了小GTP酶的異戊烯化,導致破骨細胞喪失皺褶緣,干擾肌動蛋白環(huán)形成和質子泵的泌H<'+>功能,

3、誘導細胞凋亡. 一個通常的誤解認為二磷酸鹽的作用機理只特異性針對破骨細胞.現(xiàn)在越來越多的研究表明二磷酸鹽對成骨細胞也起作用.研究發(fā)現(xiàn):二磷酸鹽除能抑制人的成骨細胞系凋亡,還能抑制鼠的骨細胞系和成骨細胞系的凋亡;阿倫磷酸和伊替磷酸增強IL-6在成骨細胞中的表達;在對犬的全髖置換模型中發(fā)現(xiàn),二磷酸鹽除了能抑制磨損碎屑引起的骨質溶解,還使髖臼假體植入孔內(nèi)的礦化骨量增加了115﹪.這些研究結果反映了二磷酸鹽對成骨細胞可能具有直接的合成作

4、用. 然而,目前就二磷酸鹽對成骨細胞的作用仍然存在著眾多分歧.有研究者發(fā)現(xiàn)阿倫磷酸能增加成骨細胞及成骨前體細胞的數(shù)量;而另有研究者則認為阿倫磷酸無此作用.一些實驗報道了高濃度的二磷酸鹽能抑制成骨細胞增殖,導致骨礦化受損;而另一些實驗發(fā)現(xiàn)相對高濃度的二磷酸鹽能影響細胞增殖,并促進I型膠原、堿性磷酸酶、骨橋蛋白及骨涎蛋白在成骨細胞中的表達. 由此可見,各種二磷酸鹽究竟具體對成骨細胞起什么樣的作用,作用的機理是什么,何種濃度為

5、最佳濃度,都還不甚清楚.研究目的在本次實驗中我們將分析證實二磷酸鹽對成骨細胞增殖及分化成熟的作用,并進一步探討二磷酸鹽在何種濃度下發(fā)揮其最大效能. 材料與方法:人成骨樣MG一63細胞以4*10<'5>/cm<'2>接種于H-DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10﹪胎牛血清,10mM β-磷酸甘油,50ng/ml L-抗壞血酸)中,于37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度孵箱內(nèi)孵育. 每3-4天細胞長滿單層,用0.25﹪胰蛋白酶消化傳代.傳

6、代后,將MG-63細胞分為5組:第一組為空白對照組,不加誘導劑,常規(guī)培養(yǎng);第二組為陽性對照組,加入10<'-8>M地塞米松;第三、四、五組為實驗組,分別加入10<'-6>M、10<'-8>M、10<'-10>M阿倫磷酸.培養(yǎng)數(shù)日后,行TMTT、堿性磷酸酶(ALP)活性、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、von kossa'S染色等檢測. 采用SPSS11.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析.實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,采用on

7、e-way ANOVA和雙尾t檢驗進行統(tǒng)計學處理,以P(0.05為檢驗標準. 結果: 阿倫磷酸較對照組顯著增加MG-63細胞數(shù)目,其峰值出現(xiàn)在濃度為10<'-8>M:同時,阿倫磷酸使ALP活性增強,而且上調骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、骨鈣素(OC)、I型膠原(Coll.l)等成骨細胞相關基因的表達,刺激礦化的形成. 結論: 1.阿倫磷酸刺激成骨樣MG-63細胞增殖,顯著增加MG-63細胞數(shù)目.