重組腺病毒介導siBPR-Ⅱ抑制UHMWPE誘導破骨細胞分化成熟的作用.pdf

1、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死以及老年性髖部骨折等方面，已經(jīng)取得巨大成功，它能顯著改善患者的運動功能和生存質(zhì)量。人工關(guān)節(jié)松動失效是術(shù)后嚴重的并發(fā)癥。近年研究發(fā)現(xiàn)，假體周圍產(chǎn)生的磨損顆粒，誘導破骨細胞過度分化成熟，引起局部骨溶解是導致人工關(guān)節(jié)晚期無菌松動的最重要因素。防治術(shù)后無菌松動的關(guān)鍵即是抑制局部破骨細胞過度激活所引起的骨溶解效應。最近幾年發(fā)現(xiàn)BMPs可直接或間接調(diào)控破骨細胞的分化成熟，使我們思考是否可以通過

2、RNA干擾技術(shù)沉默BMP受體，干擾BMP通路來抑制破骨細胞的分化成熟，因為它可以作用于破骨前體細胞本身，也可調(diào)控成骨細胞對破骨細胞的影響，這將對抑制破骨細胞的分化成熟起到雙管齊下的作用，這是其它靶點及信號通路所不具備的。
　　 目的：
　　 構(gòu)建重組腺病毒siRNA-BMPR-Ⅱ，觀察其在UHMWPE誘導溶骨的小鼠植骨氣囊模型中，抑制破骨細胞分化成熟及骨溶解的作用。并通過體外培養(yǎng)原代成骨細胞與原代破骨前體細胞，觀察siB

3、MPR是否具有抑制破骨前體細胞向具有溶骨作用的成熟破骨細胞分化的間接或直接調(diào)控作用。
　　 方法
　　 1.將選定的siBMPR-Ⅱ基因片段應用到改良的AdEasy系統(tǒng)中，將siBMPR-Ⅱ基因片段克隆連接到pSES-HUS穿梭質(zhì)粒上，構(gòu)成pSES-HUS-siBMPR-Ⅱ質(zhì)粒。在基因測序后，正確的重組質(zhì)粒被Pmel酶線性化，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)導到感受態(tài)細胞Escherichiacoii BJ5183中，

4、構(gòu)成pAd-siBMPR-Ⅱ質(zhì)粒。并通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到293T細胞中進行病毒包裝。測定病毒滴度，獲得攜帶siBMPR-Ⅱ的重組腺病毒。
　　 2.在體內(nèi)研究中，首先建立小鼠植骨氣囊聚乙烯顆粒（UHMWPE）誘導破骨細胞形成的溶骨模型。通過real-time PCR、Western blot、破骨細胞TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色，相關(guān)蛋白免疫組織化學與免疫熒光等實驗方法，檢測各處理組局部破骨細胞數(shù)量及溶骨情況。觀察si

5、BMPR在體內(nèi)是否能抑制UHMwPE顆粒引起的破骨細胞過度分化成熟，減少局部溶骨的作用。
　　 3.體外實驗:原代成骨細胞與原代破骨前體細胞培養(yǎng)體系的建立。A:原代成骨細胞的分離培養(yǎng)與純化。B:原代破骨前體細胞分離與純化。
　　 (1)在原代破骨前體細胞培養(yǎng)體系中:
　　 通過檢測經(jīng)siBMPR處理過后破骨細胞形成的標志性基因及蛋白的表達，以及破骨細胞的特殊染色（抗酒石酸酸性磷酸酶染色）觀察BMP信號通路直接調(diào)控

6、破骨細胞分化成熟的作用。
　　 (2)在原代成骨細胞培養(yǎng)體系中:
　　 通過檢測經(jīng)siBMPR處理過后的成骨細胞RANKL、OPG的基因及蛋白表達情況，用以觀察siBMPR作用于破骨細胞分化成熟是否是通過間接調(diào)控作用。
　　 結(jié)果
　　 1.成功構(gòu)建表達siBMPR-Ⅱ的重組腺病毒。并通過real-time PCR，Western blot檢測，重組腺病毒siBMPR-Ⅱ可明顯減降破骨前體細胞BMPR-Ⅱ

7、基因與蛋白的表達。
　　 2.證實在UHMWPE誘導溶骨的小鼠植骨氣囊模型中，通過siRNA干擾BMPR-Ⅱ的表達，可以明顯抑制破骨細胞的分化成熟及骨的溶解。
　　 3.通過體外培養(yǎng)原代成骨細胞與原代破骨前體細胞，觀察得到siBMPR-Ⅱ可以直接抑制破骨前體細胞向具有溶骨作用的成熟破骨細胞的分化，以及調(diào)控成骨細胞OPG/RANKL的表達，間接抑制破骨細胞的分化成熟。
　　 結(jié)論
　　 本課題揭示了在磨損顆