慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾DC-STAMP表達(dá)抑制人破骨細(xì)胞成熟的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨髓瘤骨病(MBD)是由于破骨細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞的相互作用而導(dǎo)致進(jìn)行性的骨質(zhì)破壞，嚴(yán)重影響MM患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。樹(shù)突狀細(xì)胞-特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)為鼠源性破骨細(xì)胞分化成熟所必需，但其在人類(lèi)多核破骨細(xì)胞形成中作用的研究目前尚屬空白。本實(shí)驗(yàn)研究目的包括：(1)建立完整的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)誘導(dǎo)培養(yǎng)成為成熟破骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法和鑒定體系；(2)構(gòu)建并鑒定人DC-STAMP基因的真核表達(dá)載體，并分析在

2、293T細(xì)胞中的表達(dá)情況；(3)構(gòu)建并鑒定四種編碼針對(duì)人DC-STAMP基因shRNA的慢病毒載體，并篩選出特異性抑制DC-STAMP表達(dá)的最佳靶點(diǎn)；(4)采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)分析特異性抑制DC-STAMP表達(dá)后對(duì)人破骨細(xì)胞的成熟及其功能的影響，為將來(lái)DC-STAMP作為MBD及其它破骨細(xì)胞相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)。
　　 方法：⑴通過(guò)密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMNC后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，采用巨噬細(xì)

3、胞集落刺激因子(M-CSF)和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀(guān)察貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化，并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、牙本質(zhì)片的骨吸收陷窩情況以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD51/CD61表達(dá)情況分析破骨細(xì)胞的形成和活性。⑵通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)體外擴(kuò)增人類(lèi)DC-STAMP的cDNA片段，連接入真核表達(dá)載體pEGFP-N1-FLAG后進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，

4、最后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，利用倒置熒光顯微鏡和Western blot進(jìn)行表達(dá)鑒定。⑶設(shè)計(jì)并合成四條DC-STAMP靶向shRNA寡核苷酸序列，分別與pFU-GW載體連接，從而構(gòu)建編碼DC-STAMP干擾靶點(diǎn)的重組慢病毒表達(dá)載體pFU-GW-shRNA1，2，3，4，并進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定。然后分別與第二部分研究所構(gòu)建的pEGFP-DC-STAMP-FLAG融合基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)

5、染293T細(xì)胞，以攜帶陰性對(duì)照shRNA的質(zhì)粒載體為對(duì)照，采用Western blot方法篩選出具有高效率RNAi的最佳靶點(diǎn)，最后用脂質(zhì)體法將含最佳干擾靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體、包裝質(zhì)粒pHelper1.0和包膜蛋白質(zhì)粒pHelper2.0共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并進(jìn)行濃縮和測(cè)定病毒滴度。⑷首先采用免疫磁珠分選純化人PBMNC中的破骨細(xì)胞前體CD14+單核細(xì)胞，并用M-CSF和RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，加入表達(dá)EGFP的不同復(fù)感染指

6、數(shù)(MOI=0，5，10，15，20，30)慢病毒液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒的感染效率，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力狀況。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)未感染慢病毒組(Blank組)、攜帶shRNA慢病毒感染組(Lv-shRNA組)和攜帶陰性對(duì)照shRNA慢病毒感染組(Lv-NC組)DC-STAMP mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化，并用TRAP染色觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)，定量測(cè)定TRAP活性，甲苯胺藍(lán)染色和掃描電鏡觀(guān)察牙本

7、質(zhì)片的骨吸收陷窩情況。
　　 結(jié)果：①貼壁的PBMNC經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，胞體逐漸增大，形態(tài)各異，單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞融合方式形成多核巨細(xì)胞。培養(yǎng)14天后的TRAP染色可見(jiàn)巨細(xì)胞胞漿內(nèi)有紫紅色陽(yáng)性顆粒，多個(gè)細(xì)胞核，核仁清晰；流式細(xì)胞儀分析顯示，細(xì)胞表面的CD51/CD61表達(dá)較誘導(dǎo)培養(yǎng)前明顯增加，表達(dá)率為54.48％。培養(yǎng)21天后甲苯胺藍(lán)染色和掃描電鏡均顯示牙本質(zhì)片上可見(jiàn)明顯的骨吸收陷窩。②應(yīng)用RT-PCR法可成功擴(kuò)增出人DC-STAM

8、P全長(zhǎng)，片段大小約1430 bp，與預(yù)期分子大小相符。重組質(zhì)粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG經(jīng)PCR和測(cè)序證實(shí)，DC-STAMP基因已被正確插入表達(dá)載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，在倒置熒光顯微鏡下可觀(guān)察到高豐度的綠色熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h后的Western blot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞可檢測(cè)到大小約90 kDa的融合蛋白EGFP-DC-STAMP-FLAG表達(dá)。③經(jīng)PCR和測(cè)序證實(shí)，四條目的shRN

9、A序列均成功連接于慢病毒載體pFU-GW。各重組質(zhì)粒pFU-GW-shRNA分別與DC-STAMP融合基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示shRNA可抑制DC-STAMP融合蛋白的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒干擾質(zhì)粒比例為2∶1和1∶1時(shí)，shRNA4的抑制效果最好，抑制率均可達(dá)到94％以上。成功包裝和濃縮了含shRNA4和陰性對(duì)照shRNA序列的慢病毒顆粒，經(jīng)測(cè)定病毒滴度分別為1.3×109 TU/ml和1

10、.0×109TU/ml。④采用免疫磁珠陽(yáng)性分選法不僅可獲得高純度(＞90％)的CD14陽(yáng)性細(xì)胞，而且對(duì)細(xì)胞活力不會(huì)造成影響。隨著慢病毒感染量的增加(MOI=0，5，10，15，20，30)，破骨細(xì)胞表達(dá)EGFP的陽(yáng)性率也隨之升高，分別為0％，2.75％，38.86％，42.86％，43.22％和45.73％。重復(fù)感染(MOI=15)后，Lv-NC組和Lv-shRNA組細(xì)胞表達(dá)EGFP的陽(yáng)性率分別為83.51％和82.04％，且慢病毒對(duì)細(xì)

11、胞活力無(wú)造成影響。與Lv-NC組相比較，慢病毒Lv-shRNA感染后，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示DC-STAMP的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯下降，抑制效率可達(dá)100％，TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)和TRAP活性顯著降低，骨吸收陷窩也明顯減少，兩組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴采用M-CSF和RANKL誘導(dǎo)人PBMNCs分化為具有骨吸收功能的多核成熟破骨細(xì)胞的方法是可行的，本培養(yǎng)方

12、法細(xì)胞來(lái)源豐富，取材容易，培養(yǎng)體系簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便。⑵成功構(gòu)建了帶EGFP和FLAG雙標(biāo)記的DC-STAMP融合基因表達(dá)載體pEGFP-DC-STAMP-FLAG，并具有在真核細(xì)胞中表達(dá)的能力，為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。⑶成功構(gòu)建并篩選出一個(gè)高效且特異阻斷人DC-STAMP表達(dá)的RNA干擾慢病毒載體，并包裝出具有較高滴度的慢病毒，將可作為沉默人破骨細(xì)胞DC-STAMP基因的有用工具。⑷慢病毒可介導(dǎo)人類(lèi)破骨細(xì)胞高效且長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)外源性基因