慢病毒介導(dǎo)Sox9過(guò)表達(dá)和Fas干擾聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：復(fù)蘇低溫凍存的人退變髓核細(xì)胞，并觀察其活力；體外篩選最佳 Fas-siRNA并構(gòu)建其慢病毒載體；Sox9、Fas及Sox9聯(lián)合Fas體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞，并研究它們?cè)隗w外對(duì)人退變髓核細(xì)胞的影響。
　　方法：復(fù)蘇液氮儲(chǔ)存的人退變椎間盤髓核細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察其活力情況。設(shè)計(jì) Fas-siRNA-慢病毒載體，經(jīng)酶切和基因測(cè)序鑒定重組克隆，對(duì) Fas-siRNA進(jìn)行慢病毒包裝，并檢測(cè)其滴度。將Sox9過(guò)表達(dá)和Fas干擾以

2、慢病毒為載體在體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為了便于熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率，用紅色熒光標(biāo)記Sox9基因，藍(lán)色熒光標(biāo)記Fas基因。實(shí)驗(yàn)分為①空白對(duì)照組；②陰性對(duì)照組；③Sox9過(guò)表達(dá)組；④Fas干擾組；⑤Sox9過(guò)表達(dá)+Fas干擾組。攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞72h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，而檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率；CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；RT-PCR檢測(cè)各組Sox9、Fas、Ⅱ型膠原、蛋白多糖在mRNA水平的表達(dá)

3、情況；Western-Blot分別檢測(cè)各組Ⅱ型膠原、蛋白多糖在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：人退變髓核細(xì)胞成功復(fù)蘇培養(yǎng)后，細(xì)胞生長(zhǎng)正常、狀態(tài)良好。經(jīng)酶切及重組克隆基因測(cè)序鑒定顯示，應(yīng)用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建Fas-siRNA慢病毒載體，檢測(cè)滴度大于1x108TU/ml。熒光顯微鏡觀察72h后③、④、⑤組的載體轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞其轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80%以上。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示與①組相比②組細(xì)胞增殖變化不大，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0

4、.05）；③組、④組、⑤組與①組相比細(xì)胞增殖率均有明顯增高，其中⑤組的細(xì)胞增殖率增高最為顯著，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)方法證實(shí)在Sox9、Fas、Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA表達(dá)水平上①組與②組相比變化不大，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③組中Sox9的mRNA表達(dá)升高明顯，④組中Fas的mRNA表達(dá)水平降低明顯，⑤組中Sox9的mRNA表達(dá)水平升高最為顯著、Fas的mRNA表達(dá)水平降低最為顯著，

5、與①組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明與①組相比②組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)變化不明顯，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③組、④組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)均有明顯升高，⑤組升高最為顯著，與①組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的Fas-siRNA可以顯著抑制人退變髓核細(xì)胞中Fas基因的表達(dá)；上調(diào)Sox9基因的表達(dá)及沉默F(xiàn)as基因的表達(dá)能夠增加人退變髓核細(xì)胞外基