腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CTGF和TIMP1雙基因聯(lián)合體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)觀察.pdf

1、目的：構(gòu)建人結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metaUoproteinases 1，TIMP1)基因的腺相關(guān)病毒(adeno associated virus，AAV)雙表達重組質(zhì)粒pSNAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1，體外檢測生物學(xué)活性后進行病毒包裝，并評價CTGF和TIMP1基因逆轉(zhuǎn)人腰椎

2、間盤退變的可行性。 方法：對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSNAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1進行PCR鑒定、酶切鑒定和測序，用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293(HEK293)細(xì)胞，通過雙重免疫熒光、Western blot、MTT法和ELISA等方法檢測細(xì)胞因子CTGF和TIMP1蛋白的生物學(xué)活性。在此基礎(chǔ)上進行病毒顆粒包裝。rAAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1感染體外分離培養(yǎng)并鑒定的人退變腰椎間盤髓核細(xì)胞，通過細(xì)

3、胞形態(tài)學(xué)觀察、氯胺T法、免疫組織化學(xué)法、<'35>S整合法以及Antonopoulos法等檢測CTGF和TIMP1對于人退變腰椎間盤髓核細(xì)胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成的影響。 結(jié)果：成功構(gòu)建了含有完全正確的CTGF和TIMP1基因序列的AAV重組質(zhì)粒。包裝出的具有生物學(xué)活性的rAAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1病毒能夠感染人退變腰椎間盤髓核細(xì)胞。CTGF和TIMP1聯(lián)合可以促進髓核細(xì)胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成。