老化髓核細胞的致退變效應(yīng)及其機制的探索.pdf

1、目的:
　　體外建立人髓核細胞復制性老化和血清剝奪誘導老化的模型，探索兩種老化髓核細胞對正常髓核細胞的致退變效應(yīng)并探索其機制。
　　方法:
　　1、體外連續(xù)傳代、培養(yǎng)人正常髓核細胞，模擬髓核細胞復制性老化過程;
　　2、體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)第9代髓核細胞，誘導髓核細胞老化;
　　3、分別對步驟1中的各代細胞及步驟2中的細胞行顯微鏡觀察髓核細胞形態(tài)、SA-β-Gal染色計數(shù)細胞老化率、流式細胞儀檢測G1期細胞

2、比例，制備兩組髓核細胞老化模型（本研究中擬定老化率≥80％、G1期細胞≥80％的造模組為合格的髓核細胞老化模型）;
　　4、免疫熒光法觀察P9代髓核細胞中TGF-β1的表達，同時對第9代髓核細胞、復制性老化模型、血清剝奪誘導老化模型3組細胞，采用QRT-PCR檢測3組細胞TGF-β1的表達含量;
　　5、建立老化髓核細胞和正常髓核細胞共培養(yǎng)體系，觀察共培養(yǎng)體系中正常髓核細胞的活力指標，Western-blot檢測共培養(yǎng)體系中

3、正常髓核細胞中ERK、Akt兩條信號傳導通路的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、在建立髓核細胞復制性老化模型過程中，隨著細胞傳代次數(shù)的增加，髓核細胞形態(tài)逐漸由類圓形、星形、短梭形向長梭形、不規(guī)則形等轉(zhuǎn)變，細胞體積逐漸增大、胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計數(shù)髓核細胞老化率、流式細胞儀檢測G1期細胞比例，傳至P13代時兩者比例分別為84.13±4.7％、87.59±3.0％;
　　2、在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)髓核細

4、胞的模型中，第7d觀察髓核細胞形態(tài)，細胞形態(tài)呈不規(guī)則形、長梭形轉(zhuǎn)變，胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計數(shù)髓核細胞老化率、流式細胞儀檢測G1期細胞比例較含10％胎牛血清組明顯增高，其中SA-β-Gal染色計數(shù)髓核細胞老化率為86.70±6.0％，流式細胞儀檢測G1期細胞比例為88.34±4.4％;
　　3、免疫熒光法檢測提示P9代髓核細胞表達TGF-β1，QRT-PCR實驗結(jié)果顯示，在復制性老化模型和血清剝奪誘導老化模

5、型中，TGF-β1的表達量較正常髓核細胞均有所減少，差異較對照組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，兩個老化模型組中TGF-β1的表達量相近，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);
　　4、在老化髓核細胞與正常髓核細胞共培養(yǎng)體系中，第7d觀察共培養(yǎng)體系中正常髓核細胞的活力指標，發(fā)現(xiàn)實驗組A（復制老化髓核細胞（P13代）與正常髓核細胞共培養(yǎng)）、實驗組B（血清剝奪誘導老化的髓核細胞與正常髓核細胞共培養(yǎng)）中老化率及G1期細胞比例較對照組（單純正常

6、髓核細胞培養(yǎng)）中均有所上升，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);Western-blot檢測提示對照組、實驗組A、實驗組B中正常髓核細胞中ERK、Akt表達無明顯差異，實驗組A、實驗組B中正常髓核細胞的pERK、pAkt較對照組表達減少。
　　結(jié)論:
　　1、通過體外連續(xù)性傳代培養(yǎng)人正常髓核細胞（至P13代髓核細胞），其老化率及G1期細胞比例逐漸增加，成功建立髓核細胞復制性老化模型;
　　2、通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人正