水通道蛋白1在老化退變髓核中的表達及滲透壓、氧分壓影響其表達的實驗研究.pdf

1、前言：水通道蛋白1(Aquaporin1,AQP-1)是一類跨膜通道蛋白家族的一員,具有特異雙向水通透性。在類風濕關節(jié)炎和關節(jié)水腫中,AQP-1可能參與軟骨細胞體積和水平衡的調(diào)節(jié)。有報道發(fā)現(xiàn)AQP-1在正常椎間盤髓核(Nucleus Pulposus,NP)表達,但未見其在老化退變NP的表達及可能功能的報道。細胞外環(huán)境發(fā)生不同改變時,細胞需重構細胞外基質(zhì)來維持組織結(jié)構的穩(wěn)態(tài)。椎間盤細胞,尤其是NP細胞處于一獨特的細胞外環(huán)境中:低氧,酸性

2、和持續(xù)高應力、高滲透壓狀態(tài)。在老化退變的椎間盤內(nèi),細胞外基質(zhì)及外環(huán)境變化,細胞必須通過不同機制,如:主動的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運,維持椎間盤的穩(wěn)態(tài)。研究表明NP細胞在不同細胞外環(huán)境改變時,其形態(tài)、功能發(fā)生顯著變化,但確切機制不明確。AQP-1可能通過主動轉(zhuǎn)運小而關鍵的分子影響細胞與外環(huán)境的交互作用。那么髓核細胞在滲透壓、氧分壓變化下發(fā)生什么樣的功能改變,AQP-1對NP細胞適應這些變化能發(fā)揮什么樣的功能呢?
　　 目的：本實驗通過測定AQP-

3、1在老化退變腰椎NP中的表達,初步探討其在老化退變NP的可能功能;通過觀察在不同滲透壓、氧分壓下NP細胞表達AOP-1的差異,初步探討NP細胞在滲透壓、氧分壓改變時的反應以及AQP-1可能對NP細胞在適應滲透壓、氧分壓變化時發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 1、HE和免疫組化12只日本大白兔按年齡(0.5歲青年,1歲成年,3歲老年)分3組(n=4)。每組1只兔腰椎準備HE和免疫組化染色。每組另3只兔用于免疫印跡分析。HE

4、和免疫組化染色按常規(guī)步驟進行。所有結(jié)果在顯微鏡下觀察數(shù)碼相機取相。
　　 2、細胞培養(yǎng)6只成年兔用于NP細胞培養(yǎng),一部分細胞種植于蓋玻片上用于HE和免疫組化染色。在不同條件下培養(yǎng)后,一部分細胞測定活性率,其余細胞置于液氮中凍存,準備總RNA提取。
　　 3、細胞活性率將用于細胞活性率計數(shù)的細胞制備成單細胞懸液,稀釋。將細胞懸液與臺盼藍溶液混勻后,短時間內(nèi)分別計數(shù)活細胞和死細胞,計算細胞活性率。
　　 4、免疫印跡

5、分析每組3只動物腰椎NP組織快速取出后凍存。免疫印跡分析檢測在不同年齡NP組織中,AQP-1和2型膠原的表達差異。
　　 5、實時定量PCR用于檢測NP細胞關鍵蛋白和AQP-1在不同培養(yǎng)條件下的表達差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、HE和免疫組化在青年和成年動物NP內(nèi),軟骨樣細胞聚集成簇,其間可見散在小的脊索細胞。老年NP內(nèi)細胞數(shù)量明顯下降,脊索細胞消失,軟骨樣細胞肥大。軟骨樣細胞和脊索細胞均表達AQP-1陽性。體

6、外培養(yǎng)的NP細胞表現(xiàn)異型性,AQP-1和2型膠原表達陽性。
　　 2、細胞培養(yǎng)和細胞活性率在單層培養(yǎng)早期,細胞堆積成島狀,細胞多角,有大的突起,泡狀胞質(zhì)。一段時間后細胞增生為放射狀。細胞融合層疊,細胞核清晰。細胞活性率統(tǒng)計分析顯示在不同培養(yǎng)條件下,NP細胞活性無差異。
　　 3、免疫印跡2型膠原在成年和老年動物中的表達逐級顯著下降。AQP-1在成年和老年動物中均下降,以在成年動物中下降最多。
　　 4、實時定量P

7、CR在滲透壓下降時AQP-1表達明顯下調(diào),在氧分壓下降時,AQP-1表達明顯上調(diào),而在兩者均下降時,AQP-1表達呈上升趨勢。在滲透壓/氧分壓短期快速下降時,細胞功能受顯著影響,aggrecan和2型膠原表達顯著下降,滲透壓和氧分壓均下降時,兩者下降更為明顯。
　　 討論：
　　 Sowa等研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增加,兔腰椎間盤髓核發(fā)生退行性改變。Xia等研究發(fā)現(xiàn),在退變的椎間盤髓核中,2型膠原的表達隨著退變嚴重程度增加而逐漸下

8、降。這些與本實驗在不同年齡的兔腰椎間盤中觀察到的結(jié)果相似。
　　 椎間盤老化退變降低NP細胞外滲透壓。NP細胞腫脹變形,可能通過主動跨膜轉(zhuǎn)運機制以對抗之。研究表明AQP-1被阻斷或抑制后,可以顯著增加細胞調(diào)節(jié)性體積下降,減少體積腫脹變形。在成年和老年動物髓核中,AQP-1均顯著下降。說明滲透壓下降時,NP細胞可能通過降低水的通透性,減少體積增加。在老年動物髓核中,AQP-1有所增加,說明存在其他因素影響AQP-1表達,作用與滲透

9、壓相反。
　　 正常NP細胞處于低氧環(huán)境。當椎間盤退變時,其氧分壓進一步降低,嚴重影響細胞功能。細胞可能通過獲得02改善功能。研究表明AQP-1具有O2通透性,可能輔助細胞獲得更多的O2。因此,在氧分壓降低時NP細胞可能通過增加AQP-1表達以獲得O2,減少低氧帶來的傷害。機械應力是影響椎間盤退變的另一重要因素。隨著椎間盤老化退變的發(fā)展,應力對細胞的傷害逐漸加重。Baetz等發(fā)現(xiàn)在AQP-1過表達情況下,細胞對抗應力傷害的能力增

10、加。因此,在老年動物,NP細胞可能通過增加AQP-1的表達,來抵抗機械應力的傷害。
　　 Fischbarg等發(fā)現(xiàn)敲除AQP-1后,細胞表現(xiàn)顯著的調(diào)節(jié)性體積下降(僅為對照的60％)。而當AQP-1被HgCl2或siRNA抑制后,細胞快速體積變化明顯降低。另外NP細胞可通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶來適應滲透壓下降。該激酶可以降低AOP-1表達。因此,滲透壓降低時,NP細胞可能通過降低AQP-1表達調(diào)控水在細胞內(nèi)外分布以減少細胞體積增

11、加,進而維持主要功能和活性。氧分壓降低時,NP細胞代謝下降。說明NP細胞需要O2參與代謝,然而其獲得O2的途徑尚不明確。研究表明AQP-1具有O2通透性,并可能輔助細胞獲得更多的02。體外實驗結(jié)果顯示,在氧分壓降低時,NP細胞表達AQP-1增加,說明NP細胞可能通過AQP-1獲得O2以對抗低氧分壓帶來的傷害。而當滲透壓和氧分壓同時下降時,NPC表達AQP-1為上升趨勢,說明可能存在兩種不同的,互相矛盾的調(diào)控機制影響AQP-1的表達,NP

12、細胞可能對氧分壓下降更敏感,會傾向于對自己更有利的一面調(diào)節(jié)結(jié)論AQP-1在不同年齡段兔腰椎NP組織中表達不同,反映AQP-1可能參與老化退變椎間盤NP細胞與外環(huán)境的交互作用。滲透壓和氧分壓是NP細胞外環(huán)境的重要組成因素,其改變顯著影響NP細胞功能,但未影響細胞活性。AQP-1具有水和O2通透性,能調(diào)節(jié)細胞體積和幫助細胞獲得O2。NP細胞在不同滲透壓和氧分壓下表達AQP-1不同,提示AQP-1可能參與調(diào)節(jié)NP細胞適應滲透壓、氧分壓下降的變