IGF-1促進(jìn)大鼠退變髓核細(xì)胞Aggrecan和Ⅱ型膠原的表達(dá)及其機(jī)制.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建大鼠椎間盤(pán)退變模型以模擬人類(lèi)椎間盤(pán)退變，為下一部分研究提供大量適度退變的髓核細(xì)胞。
　　方法:
　　60只SD大鼠，采用27G針在C臂機(jī)透視引導(dǎo)下行后路穿刺損傷L45、L56椎間盤(pán)纖維環(huán)，分別于術(shù)前、術(shù)后2周、術(shù)后4周、術(shù)后8周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)行MRI掃描改良Thompson分級(jí)；組織切片HE染色、Masson染色；RT-PCR檢測(cè)聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型膠原、Sox-9、Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)

2、，以確定椎間盤(pán)退變程度。
　　結(jié)果:
　　MRI：大鼠造模術(shù)后2周，大多數(shù)椎間盤(pán)信號(hào)未見(jiàn)明顯改變，僅少數(shù)髓核信號(hào)強(qiáng)度較術(shù)前強(qiáng)度稍低；術(shù)后4周，T2加權(quán)像髓核信號(hào)強(qiáng)度與鄰近節(jié)段椎間盤(pán)相比稍有降低，髓核偏灰色，絕大多數(shù)椎間盤(pán)呈改良Thompson2-3級(jí)退變；術(shù)后8周，T2加權(quán)像椎間盤(pán)髓核信號(hào)強(qiáng)度有明顯降低，部分椎間盤(pán)甚至呈“黑椎間盤(pán)”樣改變；改良Thompson等級(jí)隨造模時(shí)間延長(zhǎng)漸升高（p<0.05）。
　　組織HE染色

3、及Masson染色：隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，纖維環(huán)膠原纖維各層間逐漸出現(xiàn)裂隙，甚至斷裂，髓核內(nèi)脊索細(xì)胞及軟骨樣細(xì)胞漸減少，髓核與纖維環(huán)界限漸不清晰。
　　RT-PCR顯示隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，Aggrecan、Ⅱ型膠原、Sox-9的mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，而Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)后路在C臂機(jī)透視引導(dǎo)下采用27G穿刺針損傷SD大鼠腰椎間盤(pán)纖維環(huán)，該方法創(chuàng)傷小、出血少、可控性強(qiáng)、成功率高，經(jīng) MR

4、I、組織學(xué)及RT-PCR檢測(cè)，椎間盤(pán)退變速度緩慢，能模擬人類(lèi)椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程，該動(dòng)物模型的成功建立為本研究提供大量退變髓核細(xì)胞。
　　第二部分IGF-1促進(jìn)大鼠退變的髓核細(xì)胞Aggrecan及Ⅱ型膠原的表達(dá)
　　目的:
　　研究胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF-1）對(duì)大鼠退變的髓核細(xì)胞Aggrecan及Ⅱ型膠原基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響，對(duì)大鼠退變髓核細(xì)胞增殖的影

5、響。
　　方法:
　　針刺損傷致大鼠腰椎間盤(pán)退變后，選擇MRI表現(xiàn)為輕-中度退變（改良Thompson2-3級(jí)）的椎間盤(pán)，行髓核細(xì)胞體外分離貼壁培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　將不同濃度（0、20、50、100、200ng/ml）的IGF-1作用于貼壁培養(yǎng)的P2代細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)IGF-1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　1%藻酸鹽包被P2代髓核細(xì)胞三維培養(yǎng)，經(jīng)不同濃度（0、20、50、100、2

6、00ng/ml）的IGF-1作用12小時(shí)后提取RNA，采用RT-PCR檢測(cè)髓核細(xì)胞Aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)。
　　三維培養(yǎng)的大鼠退變髓核細(xì)胞，采用100ng/ml的IGF-1作用24小時(shí)，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)Aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　大鼠退變的髓核細(xì)胞貼壁緩慢，細(xì)胞呈梭形、多角形，原代細(xì)胞存活率可達(dá)91-96%，傳代后細(xì)胞存活率稍降低。
　　MTT法結(jié)

7、果顯示：隨IGF-1濃度增加，OD570nm吸光度值漸升高，100ng/ml組細(xì)胞增殖能力增加了約66%（p<0.05），而200ng/ml組與100ng/ml組間OD570nm吸光度值無(wú)顯著差異（p>0.05）。
　　RT-PCR結(jié)果顯示：隨IGF-1濃度的增高，髓核細(xì)胞Aggrecan、Ⅱ型膠原的mRNA的表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢(shì)（p<0.05），而100ng/ml組和200ng/ml組間無(wú)顯著差異（p>0.05）。
　　

8、Western-blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，100ng/ml的IGF-1能顯著提升髓核細(xì)胞Aggrecan和Ⅱ型膠原的蛋白表達(dá)水平（p<0.01）。
　　結(jié)論:
　　IGF-1可促進(jìn)大鼠退變髓核細(xì)胞增殖；IGF-1可促進(jìn)退變髓核細(xì)胞Aggrecan及Ⅱ型膠原基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)。IGF-1作為一種細(xì)胞因子，可用于椎間盤(pán)退變生物學(xué)治療的研究。
　　第三部分IGF-1通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)退變髓核細(xì)胞Aggr

9、ecan及Ⅱ型膠原的表達(dá)
　　目的:
　　分析探討IGF-1主要通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制來(lái)促進(jìn)大鼠退變髓核細(xì)胞Aggrecan及Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　方法:
　　三維培養(yǎng)的P2代髓核細(xì)胞血清饑餓12小時(shí)后，按處理方法不同分為4組：對(duì)照組、IGF-1組（100ng/ml）、LY294002組（50μM，PI3K/Akt通路抑制劑）、IGF-1+LY294002組，采用Western-blot方法檢測(cè)IGF-1對(duì)磷脂酰肌

10、醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase，PI3K/Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活作用；檢測(cè)LY294002對(duì)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。
　　三維培養(yǎng)的P2代髓核細(xì)胞血清饑餓12小時(shí)后，按處理方法不同分為4組：對(duì)照組、IGF-1組、LY294002組、IGF-1+LY294002組，采用Western-blot方法檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活或抑制對(duì)大鼠退變髓核細(xì)胞Aggrecan及Ⅱ型膠原表達(dá)

11、的影響。
　　結(jié)果:
　　Western-blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，IGF-1能促進(jìn)PI3K及Akt的磷酸化（p<0.01），激活PI3K/Akt信號(hào)通路；與IGF-1組相比，IGF-1+LY294002組的PI3K及Akt的磷酸化水平均顯著降低（p<0.01）。
　　Western-blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，IGF-1能明顯促進(jìn)退變髓核細(xì)胞Aggrecan和Ⅱ型膠原的表達(dá)（p<0.01）；與IGF-1組相