SIRT1調(diào)節(jié)TNF-α誘導退變髓核細胞趨化因子MCP-1表達及相關(guān)作用機制.pdf

1、第一部分人退變髓核組織中髓核細胞的體外分離、培養(yǎng)
　　目的:熟悉并掌握原代髓核細胞分離、提取、培養(yǎng)技術(shù)，為后續(xù)實驗提供足夠的細胞來源。
　　方法:肉眼分離髓核組織，利用0.25％胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶提取髓核細胞，采用COL2A1免疫熒光實驗對髓核細胞進行鑒定。通過Western Blot和實時熒光定量PCR實驗比較凍存、未凍存、平面、藻酸鹽三維培養(yǎng)對髓核細胞COL2A1表達影響。
　　結(jié)果:成功運用0.25％胰酶聯(lián)合Ⅱ型

2、膠原酶提取出髓核細胞，COL2A1免疫熒光結(jié)果與髓核細胞相符。髓核細胞凍存后COL2A1表達明顯減少(P＜0.05)，藻酸鹽三維培養(yǎng)髓核細胞能夠增加COL2A1表達(P＜0.05)。
　　結(jié)論:胰酶、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法能夠成功提取髓核細胞。髓核細胞凍存后表型丟失，而藻酸鹽三維培后表型可得到一定恢復。
　　第二部分 SIRT1對TNF-α誘導髓核細胞表達趨化因子MCP-1的影響
　　目的:明確SIRT1對TNF-α誘導

3、髓核細胞表達趨化因子MCP-1的影響。
　　方法:TNF-α在不同時間（12小時/24小時）不同劑量（5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml）誘導髓核細胞后，通過流式細胞周期觀察細胞增殖情況，Western Blot，實時熒光定量PCR實驗檢測表達MCP-1情況。在SIRT1激動劑白藜蘆醇、SIRT1抑制劑尼克酰胺、SIRT1小干擾RNA預處理細胞后，利用Western Blot、實時熒光定量PCR檢測TNF-α誘導髓核細胞

4、表達MCP-1情況。
　　結(jié)果:各組TNF-α刺激對細胞活性無顯著影響(P＞0.05)，TNF-α刺激髓核細胞在24小時，20ng/ml濃度時MCP-1表達最高(P＜0.05)。SIRT1激動劑白藜蘆醇預處理明顯減少TNF-α誘導髓核細胞MCP-1表達(P＜0.05)，SIRT1抑制劑尼克酰胺預處理明顯增加TNF-α誘導髓核細胞MCP-1(P＜0.05)表達。SIRT1小干擾RNA轉(zhuǎn)染明顯增加TNF-α誘導髓核細胞MCP-1表達(

5、P＜0.05)。
　　結(jié)論:實驗證明SIRT1能夠抑制TNF-α誘導髓核細胞表達MCP-1。
　　第三部分 SIRT1抑制TNF-α誘導退變髓核細胞MCP-1表達的相關(guān)作用機制
　　目的:探索SIRT1能夠抑制TNF-α誘導髓核細胞表達MCP-1可能存在的作用機制。
　　方法:利用AP-1抑制姜黃素和TNF-α處理髓核細胞，WesternBlot及實時熒光定量PCR實驗檢測MCP-1表達情況。SIRT1激動劑白藜

6、蘆醇和TNF-α處理細胞后，免疫熒光實驗、Western Blot（核蛋白）檢測c-Jun（AP-1亞基）定位及表達情況。通過EMSA實驗檢測白藜蘆醇、SIRT1小干擾RNA預處理后，TNF-α誘導髓核細胞中AP-1活性。
　　結(jié)果:使用AP-1抑制劑姜黃素處理后，TNF-α誘導髓核細胞MCP-1表達明顯減少(P＜0.05)。免疫熒光和Western Blot（核蛋白）發(fā)現(xiàn)SIRT1激動劑白藜蘆醇可以減少AP-1亞基c-Jun在核