SIRT1調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)退變髓核細(xì)胞趨化因子MCP-1表達(dá)及相關(guān)作用機(jī)制.pdf

1、第一部分人退變髓核組織中髓核細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)
　　目的:熟悉并掌握原代髓核細(xì)胞分離、提取、培養(yǎng)技術(shù)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠的細(xì)胞來(lái)源。
　　方法:肉眼分離髓核組織，利用0.25％胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶提取髓核細(xì)胞，采用COL2A1免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行鑒定。通過(guò)Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)比較凍存、未凍存、平面、藻酸鹽三維培養(yǎng)對(duì)髓核細(xì)胞COL2A1表達(dá)影響。
　　結(jié)果:成功運(yùn)用0.25％胰酶聯(lián)合Ⅱ型

2、膠原酶提取出髓核細(xì)胞，COL2A1免疫熒光結(jié)果與髓核細(xì)胞相符。髓核細(xì)胞凍存后COL2A1表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，藻酸鹽三維培養(yǎng)髓核細(xì)胞能夠增加COL2A1表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:胰酶、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法能夠成功提取髓核細(xì)胞。髓核細(xì)胞凍存后表型丟失，而藻酸鹽三維培后表型可得到一定恢復(fù)。
　　第二部分 SIRT1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞表達(dá)趨化因子MCP-1的影響
　　目的:明確SIRT1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)

3、髓核細(xì)胞表達(dá)趨化因子MCP-1的影響。
　　方法:TNF-α在不同時(shí)間（12小時(shí)/24小時(shí)）不同劑量（5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml）誘導(dǎo)髓核細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞周期觀(guān)察細(xì)胞增殖情況，Western Blot，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)MCP-1情況。在SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇、SIRT1抑制劑尼克酰胺、SIRT1小干擾RNA預(yù)處理細(xì)胞后，利用Western Blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞

4、表達(dá)MCP-1情況。
　　結(jié)果:各組TNF-α刺激對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)，TNF-α刺激髓核細(xì)胞在24小時(shí)，20ng/ml濃度時(shí)MCP-1表達(dá)最高(P＜0.05)。SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇預(yù)處理明顯減少TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞MCP-1表達(dá)(P＜0.05)，SIRT1抑制劑尼克酰胺預(yù)處理明顯增加TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞MCP-1(P＜0.05)表達(dá)。SIRT1小干擾RNA轉(zhuǎn)染明顯增加TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞MCP-1表達(dá)(

5、P＜0.05)。
　　結(jié)論:實(shí)驗(yàn)證明SIRT1能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞表達(dá)MCP-1。
　　第三部分 SIRT1抑制TNF-α誘導(dǎo)退變髓核細(xì)胞MCP-1表達(dá)的相關(guān)作用機(jī)制
　　目的:探索SIRT1能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞表達(dá)MCP-1可能存在的作用機(jī)制。
　　方法:利用AP-1抑制姜黃素和TNF-α處理髓核細(xì)胞，WesternBlot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCP-1表達(dá)情況。SIRT1激動(dòng)劑白藜

6、蘆醇和TNF-α處理細(xì)胞后，免疫熒光實(shí)驗(yàn)、Western Blot（核蛋白）檢測(cè)c-Jun（AP-1亞基）定位及表達(dá)情況。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇、SIRT1小干擾RNA預(yù)處理后，TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞中AP-1活性。
　　結(jié)果:使用AP-1抑制劑姜黃素處理后，TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞MCP-1表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。免疫熒光和Western Blot（核蛋白）發(fā)現(xiàn)SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇可以減少AP-1亞基c-Jun在核