慢病毒介導(dǎo)RNA干擾Clusterin基因?qū)δI癌786-O細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，就診時(shí)多數(shù)已是中晚期，且對(duì)化療和放療均不敏感，因此尋找腎癌新的治療方法有其現(xiàn)實(shí)意義。RNAi是指由外源雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)細(xì)胞后引起的與其同源序列的mRNA特異性降解而導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象，作為一項(xiàng)新的基因阻斷技術(shù)，有望成為新一代抗腫瘤的重要工具。近年來(lái)抗凋亡因子Clusterin(CLU)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注，有望成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。200

2、6年1月本課題組研究發(fā)現(xiàn)CLU蛋白在腎癌中表達(dá)增加，并且其表達(dá)強(qiáng)度與腎癌惡性化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡間均存在相關(guān)性，但CLU是否參與腎癌惡性生物學(xué)行為的調(diào)控及如何調(diào)控尚不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)CLU基因在人腎癌786-O細(xì)胞中明顯表達(dá)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)合成針對(duì)CLU基因的siRNA，通過與pGCSIL-GFP載體進(jìn)行重組慢病毒表達(dá)載體。利用包裝細(xì)胞293T獲得重組的慢病毒，感染人腎癌786-O細(xì)

3、胞，建立CLU基因穩(wěn)定干擾的人腎癌786-O細(xì)胞系，為CLU基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。利用特異性地阻斷腎癌786-O細(xì)胞系中CLU基因的表達(dá)，檢測(cè)CLU基因沉默在人腎癌786-O細(xì)胞的干擾效果及其對(duì)人腎癌786-O細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響以及相關(guān)基因的差異表達(dá)，探討CLU基因的可能作途徑及RNAi阻斷策略抑制CLU蛋白表達(dá)對(duì)腎癌治療的可行性。
　　 方法:
　　 1、應(yīng)用質(zhì)粒重組技術(shù)以人CLUmRNA編碼序列作為干擾靶點(diǎn)

4、，與pGCSIL-GFP載體定向連接，構(gòu)建pGCSIL-GFP表達(dá)載體，分別命名為CLU-RNAi-LV1#，2#，3#。另外構(gòu)建不針對(duì)任何已知mRNA的陰性對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒。慢病毒載體法將CLU正義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用包裝細(xì)胞293T獲得重組的慢病毒，分別感染人腎癌786-O細(xì)胞株及ACHN細(xì)胞株。經(jīng)過抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CLU-RNAi-LV1#，2#，3#的細(xì)胞株。熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)、滴度測(cè)定，用786-

5、O細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　 2、運(yùn)用Real-timePCR和Western分別檢測(cè)786-O細(xì)胞株及ACHN細(xì)胞株中CLUmRNA轉(zhuǎn)錄水平及CLU蛋白表達(dá)水平的變化。應(yīng)用MST-1法檢測(cè)786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CLU沉默后腎癌786-O細(xì)胞在增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為的改變。
　　 1)RealTime-PCR、Westernblot檢測(cè)RNAi作用下786-O細(xì)胞與ACHN細(xì)胞中CLU

6、mRNA及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá);
　　 2)MST-1法觀察抑制CLU基因表達(dá)對(duì)786-O細(xì)胞及ACHN細(xì)胞增殖能力的影響;
　　 3)細(xì)胞劃痕實(shí)比較RNAi抑制CLU基因前后786-O細(xì)胞遷移能力的改變。
　　 4)流式細(xì)胞術(shù)Hoechst33342/PI雙染法比較RNAi抑制CLU基因前后786-O細(xì)胞凋亡率的改變。
　　 3、運(yùn)用全基因組芯片檢測(cè)CLU基因干擾前后相關(guān)基因的差異表達(dá)情況。
　　 統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)處理
　　 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用(x-)±s表示。計(jì)量資料進(jìn)行one-wayANOVA單因素及析因方差分析。所有檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建人CLU基因特異性的重組慢病毒干擾載體CLU-RNAi-LV并獲得相應(yīng)的慢病毒，病毒懸液滴度4×108TU/mL。成功建立3組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CLU基因的腎癌細(xì)胞株CLU-RNAi-LV1#，2#，

8、3#。
　　 2、RealTime-PCR、Westernblot結(jié)果顯示786-O細(xì)胞株中CLUmRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平高于ACHN細(xì)胞株。786-O細(xì)胞中CLUmRNA表達(dá)量是ACHN細(xì)胞的2.44倍。兩組CLUmRNA表達(dá)量三次平均△CT為13.67，F(xiàn)=84.944，P=0.012＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 干擾組CLUmRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，腎癌786-O細(xì)胞的增殖、遷移受到抑制

9、，而凋亡率增加。通過RNA干擾作用有效地下調(diào)了786-O細(xì)胞中CLU基因在mRNA與蛋白水平上的表達(dá)，同時(shí)抑制腎癌786-O細(xì)胞的增殖、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 1)經(jīng)RealTime-PCR，Westernblot檢測(cè)證實(shí):CLU-RNAi-LV1#，2#，3#均能抑制腎癌786-O細(xì)胞及ACHN細(xì)胞中的CLUmRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)，但786-O細(xì)胞中蛋白表達(dá)更低。786-O細(xì)胞中三實(shí)驗(yàn)組CLUmRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比分

10、別下調(diào)91.6％，83.1％，88.4％，90.4％，69.4％，58.7％，93.6％，96.5％和0。CLU蛋白表達(dá)水平與NC組相比分別下降35.24％，46.26％，和58.91％，其中CLU-RNAi-LV3#效果較干擾效果最佳。
　　 2)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾24小時(shí)后各組0h/6h/12h/24h時(shí)點(diǎn)遷移相對(duì)距離:KD組(32.04±0.97)遷移距離遠(yuǎn)小于CON組(19.48±1.30)、NC組(19.67±

11、4.94)(F=15.274，P＜0.001)。三組間差別進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=364.367，P＜0.001)，分組和時(shí)間存在交互效應(yīng)(F=7.248，P＜0.001)。而NC組細(xì)胞和CON組間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.959＞0.05)。顯示RNAi后細(xì)胞的遷移能力下降。顯示RNAi抑制細(xì)胞的惡性進(jìn)展能力。
　　 3)MST-1法觀察抑制CLU蛋白表達(dá)對(duì)

12、786-O細(xì)胞增殖的影響:檢測(cè)CLU基因沉默后的786-O細(xì)胞即實(shí)驗(yàn)組(OD值0.3413±0.0345)生長(zhǎng)速度較NC組(OD值0.4175±0.0554)及CON組(OD值0.4145±0.0231)明顯下降(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后72h實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率為15.66％。顯示RNAi抑制細(xì)胞的增殖能力。
　　 4)流式細(xì)胞儀Hoechst33342/PI雙染法比對(duì)RNAi抑制CLU基因前后786-O細(xì)胞凋亡率的改變;RNA干

13、擾72h后786-O細(xì)胞凋亡率為6.30％±3.17％，陰性對(duì)照組及空白組分別為1.20％±0.40％，1.01％±0.37％(n=3)(P＜0.01)。RNAi抑制sCLU表達(dá)并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。
　　 3、檢測(cè)的六份樣本中，共篩選出差異表達(dá)基因1853個(gè)，癌組織中共同上調(diào)基因1270個(gè)，共同下調(diào)基因583個(gè)。GO分析差異表達(dá)基因以生物進(jìn)程、細(xì)胞成分、分子功能方面為主。通路分析上調(diào)29條通路，細(xì)胞粘附，葡萄球菌感染，吞噬體，異體

14、排斥，自免性甲狀腺疾病，造血系統(tǒng)，病毒性心肌炎。下調(diào)31條通路，與肺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、髓細(xì)胞白血病、mTOR、MAPK等通路有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、慢病毒介導(dǎo)的CLU基因干擾能穩(wěn)定有效地表達(dá)于腎癌細(xì)胞，篩選出能穩(wěn)定干擾CLU基因表達(dá)的siRNA序列和腎癌786-O細(xì)胞株。
　　 2、CLU慢病毒干擾載體可有效沉默腎癌786-O細(xì)胞的內(nèi)源性CLU基因，下調(diào)腎癌786-O細(xì)胞CLU基因的表達(dá)。CLU基因

15、RNAi干擾后腎細(xì)胞癌786-O的增殖活性受到抑制，細(xì)胞凋亡受到促進(jìn)。針對(duì)CLU的shRNA能夠有效的阻斷腎癌細(xì)胞中CLUmRNA、蛋白的表達(dá)，并以此抑制體內(nèi)、體外細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，降低細(xì)胞耐藥性、下調(diào)細(xì)胞的侵襲、遷移能力。
　　 3、腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中與CLU基因相關(guān)的基因有相對(duì)集中區(qū)域，如1、2、6、11號(hào)染色體，上調(diào)基因還集中于X染色體，下調(diào)基因還集中于12號(hào)染色體。與凋亡相關(guān)的下調(diào)基因如AKT3，CASP3，DFFB，I