石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN的作用及機(jī)制初探.pdf

1、腎癌是一個(gè)復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，腎透明細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的分型，并且占腎實(shí)質(zhì)性腫瘤大約75％。早期局部腎癌病人在手術(shù)切除病灶后預(yù)后較好，但是，近30％的病人在初診時(shí)就發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶。與其它實(shí)質(zhì)性腫瘤相比，腎癌病人往往對(duì)放療和化療耐受，免疫治療對(duì)已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者有一定的療效。腎癌在男性的發(fā)病率高于女性，其比例約為2∶1，最常發(fā)病于50-70歲年齡段。雖然我國(guó)的發(fā)病率低于全球平均水平，但2012年我國(guó)新發(fā)型66466例，約為美國(guó)新診斷病例的兩倍，

2、此差異可能源于環(huán)境的暴露和遺傳傾向。我國(guó)腎癌在男性的發(fā)病率居所有腫瘤發(fā)病率的第七位。隨著檢查手段的不斷進(jìn)步，其發(fā)病率以每年大約2％的速率增長(zhǎng)。
　　基于目前的檢測(cè)手段，25～40％的腎癌為偶發(fā)腎癌，25～30％的病人在初診時(shí)就發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶的存在，且部分患者發(fā)生了亞臨床轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除是治愈早期診斷腎癌的主要手段。初診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移的患者其中位生存期不足一年。
　　腎癌對(duì)放、化療均不敏感，故對(duì)于已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腎癌的治療

3、手段有限。開(kāi)始于上世紀(jì)90年的以中、高劑量IL-2為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子治療客觀反應(yīng)率不足30％。在西方國(guó)家，靶向治療是晚期腎癌主要的治療手段。腎癌靶向治療主要有兩類(lèi)治療藥物，一類(lèi)是酪氨酸酶抑制劑(TKIs)靶向腫瘤血管和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑。索拉非尼是第一個(gè)獲準(zhǔn)用于治療Ⅳ期腎癌并推薦為一線或二線治療的TKIs。其它包括舒尼替尼、依維莫司及阿西替尼在內(nèi)各類(lèi)靶向藥物均存在價(jià)格昂貴或國(guó)內(nèi)人群臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果資料尚不完備等問(wèn)題。[1

4、]
　　長(zhǎng)期以來(lái)，尋找對(duì)腎癌敏感的藥物都是科研工作者及醫(yī)務(wù)人員感興趣的問(wèn)題。石蒜堿(lycorine，分子量287.313)最早由日本人森島庫(kù)太1937年從傳統(tǒng)中藥石蒜的鱗中分離得到的一種芐基苯乙胺類(lèi)生物堿。
　　活性研究表明，石蒜堿及其衍生物具有抗炎、抗病毒、抗瘧疾、抗寄生蟲(chóng)、抑制乙酰膽堿酯酶、保護(hù)心血管及抗腫瘤、及最近發(fā)現(xiàn)的抑制破骨細(xì)胞生成等多種生物學(xué)作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外合成了很多石蒜堿衍生物，如鹽酸石蒜堿(Lycori

5、ne hydrochloride)、氧化石蒜堿(Lycobetaine)、二氫石蒜堿(Dihydrolycorine)、偽石蒜堿(Pseudolycorine)及其它一些做過(guò)結(jié)構(gòu)修飾尚未命名的化合物。并對(duì)石蒜堿在各種腫瘤的作用及機(jī)制做了較多研究。目前未見(jiàn)石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞較系統(tǒng)的研究。
　　目的：
　　探討石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞786-O及ACHN的作用，觀察兩株不同惡性程度的腎癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為改變，探索其可能的作用機(jī)制;為腎癌

6、的治療尋找新的思路。
　　方法：
　　1.石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和ACHN生物學(xué)行為的影響
　　1.1 流式細(xì)胞儀分析石蒜堿對(duì)786-O及ACHN細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105mL，接種細(xì)胞到6孔板內(nèi)，放人37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，待其長(zhǎng)至50％匯合度時(shí)取出6孔板，吸盡培養(yǎng)液，依次加人預(yù)先配制好的濃度分別為0、1、2、5、10、25μmol/

7、L的石蒜堿溶液2mL于準(zhǔn)備處理的細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞及其上清液，送孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院流式細(xì)胞室檢測(cè)，同時(shí)凋亡檢測(cè)及細(xì)胞周期分析。
　　1.2 MTS檢測(cè)石蒜堿對(duì)786-O及ACHN細(xì)胞增殖的作用
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并接種到96孔板，使達(dá)到2×103個(gè)/孔。設(shè)空白組和石蒜堿處理組，每組5個(gè)復(fù)孔。放人37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后換液并對(duì)石蒜堿組加藥處理。分別于加藥后0h、24h、48h、72h

8、、96h各時(shí)間點(diǎn)加入20ul MTS，37℃孵育1h后，用酶標(biāo)儀測(cè)490nm處OD值。
　　1.3 劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)石蒜堿對(duì)786-O及ACHN細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響
　　用記號(hào)筆在六孔板底做記號(hào)，培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度達(dá)90％以上，用中槍頭在長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的六孔板中劃痕，注意比照板底記號(hào)，并于劃痕后換液（處理組加藥）。分別在劃痕后12h、24h、36h拍照，用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)劃

9、痕寬度。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)復(fù)孔。
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，設(shè)空白組和石蒜堿組（5μmol/L），無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后（石蒜堿組加0.5μmol/L預(yù)處理）胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×105/mL。將4℃過(guò)夜融化的基質(zhì)膠稀釋后加入Transwell小室，37℃溫育30min，取200ul細(xì)胞懸液加入小室，并避免產(chǎn)生氣泡（遷移實(shí)驗(yàn)則不加基質(zhì)膠）。24孔板相應(yīng)孔加入600ul含15％FBS的RPMI-1640，培養(yǎng)48h后終止

10、。PBS洗小室兩遍，棉簽拭去殘留基質(zhì)膠。先將小室置4％多聚甲醛溶液固定15min，再放入0.1％結(jié)晶紫染色液染色20min，最后以PBS清洗小室內(nèi)和底部殘留染色液，晾干后于倒置顯微鏡下觀察拍照，并采用人工計(jì)數(shù)法，取四個(gè)隨機(jī)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。
　　1.4 平板克隆形成檢測(cè)石蒜堿對(duì)786-O及ACHN細(xì)胞集落形成能力的影響
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以200/孔的密度接種到六孔板中。待細(xì)胞貼壁后換液并按正常對(duì)照組、5μmol/L石蒜堿

11、組加藥處理，靜置生長(zhǎng)10天后終止培養(yǎng)。用PBS緩慢清洗2遍后加入4％多聚甲醛固定10min，加入0.1％結(jié)晶紫染色15min，吸去染色液，風(fēng)干并拍照。人工計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的集落。
　　2.石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0作用的機(jī)制
　　2.1 用DCF-DA檢測(cè)石蒜堿處理后786-O細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化
　　2.1.1 接種細(xì)胞:使用96孔板，每孔接種1.5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
　　孵育DCFH-DA:接種24小時(shí)

12、后用PBS液洗兩遍，并換上終濃度為25μMDCFH-DA的RAPI-1640，培養(yǎng)箱孵育30 min.
　　2.1.2 結(jié)束DCFH-DA孵育后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS液小心洗兩遍。
　　2.1.3 檢測(cè)并拍照:Zeiss倒置顯微鏡檢測(cè)熒光。488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)。
　　2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)石蒜堿處理后經(jīng)典凋亡通路及NF-κB通路基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
　　Primerbank(https:/

13、/pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)查找相關(guān)基因引物，并委托上海生工公司合成引物?？俁NA提取。逆轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)基因cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR.采用2-ΔΔT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量
　　2.3 Western-blot分析相關(guān)通路蛋白的變化
　　蛋白提取
　　于4℃、×1000 rpm條件下離心5 min后收集各分組不同濃度石蒜堿處理的細(xì)胞，加入蛋白提取液200ul，1％ Triton，1

14、50 mM NaCl，25 mM Tris-HCl(pH7.2)，0.5 mM EDTA，0.5mM Na3VO及蛋白酶抑制劑雞尾酒片震蕩混勻，冰上放置30 min，4℃、×12000rpm離心30 min，取上清。
　　蛋白濃度測(cè)定及分裝
　　用BCA蛋白定量法測(cè)定各分組蛋白含量，按計(jì)算結(jié)果加5×上樣緩沖液和去離子水。95℃，5min，放-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　配膠及電泳
　　根據(jù)蛋白分子量不同，配制8～12％

15、的膠。各泳道取各分組蛋白標(biāo)本20～50ug，并加入2～4ul marker進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳，每次電泳各泳道上樣量應(yīng)一致。
　　電轉(zhuǎn)及抗體反應(yīng)
　　轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，然后依次進(jìn)行一抗和二抗反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)對(duì)照。一抗二抗反應(yīng)完均應(yīng)用TBST漂洗3次，每次5min。
　　化學(xué)發(fā)光、拍照
　　根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制免疫化學(xué)發(fā)光顯色液。上機(jī)曝光，拍照。并用QuantityONE軟件進(jìn)行灰度值分析。

16、　　結(jié)果：
　　1.石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞株786-O和ACHN細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　2.石蒜堿對(duì)腎癌細(xì)胞株786-O作用的機(jī)制研究。
　　結(jié)論：
　　1.石蒜堿對(duì)腎癌786-O、ACHN細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用;對(duì)786-O的生長(zhǎng)抑制作用更明顯。
　　2.石蒜堿對(duì)腎癌786-O、ACHN細(xì)胞均有凋亡誘導(dǎo)作用;對(duì)786-O的凋亡誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。石蒜堿能抑制腎癌786-O、ACHN細(xì)胞遷移、侵襲;
　　3.石蒜