MDR1shRNA的表達質粒構建及逆轉腎癌細胞ACHN多藥耐藥的試驗研究.pdf

1、目的：構建2條由pSIREN-RetroQ-ZsGreee(pRZ)質粒載體介導MDR1短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達載體，針對MDR1基因過度表達機制，研究干擾片段逆轉腎癌細胞ACHN多藥耐藥的可行性。
　　 方法：1)分別針對MDR1基因的兩個不同位點， 按BarnHI+Sense+Loop+Antisense+終止信號+EcorI結構合成編碼shRNA的DNA序列及其反義序列，退火連

2、接及磷酸化形成雙鏈后將其依次連入pRZ載體，構建成能產生MDR1短發(fā)卡RNA的質粒。2)體外培養(yǎng)腎癌細胞ACHN，采用脂質體介導的基因轉染方法，將構建的質粒轉染入ACHN。3)MTT法測定細胞對化療藥物阿霉素(ADM)的敏感性，免疫組織化學檢測細胞膜表面P-gp表達，半定量RT-PCR檢測MDR1基因的表達.4)采用spss16.0統計軟件進行分析處理，數據均采用x±S表示，組間比較均采用兩樣本配對t檢驗，P＜0.05表示差異有顯著性。

3、
　　 結果：構建成的質粒pRZ-A、pRZ-B(pSIREN-RetroQ-ZsGreee-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreee-B)經酶切與測序證實構建成功，無任何堿基突變；熒光倒置顯微鏡觀察并計數轉染pRZ-A和pRZ-B后24h、48h、96hACHN綠色熒光蛋白表達，其中轉染48h的綠色熒光蛋白表達最強，轉染效率分別為75.35±1.15％、74.83±1.37％；MTT顯示轉染后的ACHN顯著提高了對化療藥

4、物ADM的敏感性，ACHN空白對照組的IC50約為2.5ug/ml，轉染pRZ-A、pRZ-B ACHN IC50分別下降為0.65ug/m1、0.7ug/ml，較空白對照組分別下降了83.44％和83.42％；免疫細胞化學顯示細胞表達P-gP水平明顯降低，轉染pRZ-A 96h細胞P-gp的陽性表達率與空白對照組有差異顯著性(t=15.621 P＜0.05)，下降了44.69％。轉染pRZ-B48h(t=2.415)和96h(t=17

5、.995)的細胞P-gp的陽性表達率與空白對照組有顯著性差異(P＜0.05)，分別下降了7.32％和53.62％；半定量RT-PCR檢測轉染pRZ-A、pRZ-BMDR1 mRNA基因表達顯著降低，與未轉染ACHN相比，分別下降了82.5％和77.5％；統計學分析2條序列抑制MDR1基因表達差別無顯著性(p＞0.05)。
　　 結論：成功構建了能表達MDR1 shRNA的質粒載體pRZ-A和pRZ-B；其能有效地逆轉腎癌耐藥細胞