shRNA逆轉膀胱癌細胞BIU-87-ADM多藥耐藥的實驗研究.pdf

1、目的：構建由pSIREN-RetroQ-ZsGreeen載體介導針對MDR1基因的短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達載體，研究利用shRNA來逆轉膀胱腫瘤細胞BIU-87/ADM多藥耐藥性的可行性。
　　 方法：分別針對MDR1基因已知mRNA序列不同位點，選擇兩條靶序列，按BarnHI+Sense+Loop+Antisense+終止信號+EcorI結構合成編碼shRNA的DNA序列及其反義序列，然后利用基因重組技術構建靶向MD

2、R1shRNA真核表達載體，成功構建后通過脂質體介導將重組質粒分別轉染至膀胱腫瘤耐藥細胞BIU-87/ADM，利用RT-PCR檢測BIU-87/ADM細胞MDR1基因的表達，以及免疫組織化學檢測BIU-87/ADM細胞膜表面P-gp表達，同時利用MTT法檢測膀胱癌多藥耐藥細胞BIU-87/ADM對化療藥物阿霉素(ADM)的敏感性。最后，結果采用spss統(tǒng)計軟件進行分析處理，組間均采用兩樣本t檢驗。
　　 結果：構建成的重組質粒p

3、SIREN-RetroQ-ZsGreeen-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreeen-B經(jīng)酶切與測序證實構建成功，無任何堿基突變；將成功構建的2個重組質粒分別轉染至BIU-87/ADM細胞，24小時后通過RT-PCR檢測顯示均明顯抑制BIU-87/ADM細胞株MDR1基因表達(P＜0.05)，細胞mRNA轉錄比值分別下降了72.57％和78.88％。轉染48小時后，通過免疫組織化學檢測顯示P-gp表達率分別為48.53±2.65

4、％和43.58±2.52％，顯著低于未轉染組(P＜0.05)。同時轉染48小時后，利用MMT法檢測顯示膀胱癌耐藥株BIU-87/ADM對化療物ADM的敏感性明顯增強，對ADM藥物敏感性的相對逆轉效率分別為52.02％和54.87％(P＜0.05)。此外，2個重組質粒對逆轉膀胱癌多藥耐藥細胞BIU-87/ADM的效果無差異。
　　 結論：shRNA真核表達載體可明顯抑制BIU-87/ADM細胞MDR1 mRNA的轉錄和P-gp蛋白