野生型VHL基因提高腎細(xì)胞癌細(xì)胞786-O對TRAIL敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 實(shí)驗(yàn)研究野生型 VHL基因提高腎細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O對 TRAIL敏感性的基礎(chǔ)研究
　　目的:91％的散發(fā)性腎細(xì)胞癌患者中存在腫瘤抑制基因 von Hippel-Lindau(VHL)的突變或失活。VHL基因以及翻譯的產(chǎn)物 pVHL能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)多種與腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá),但與 TRAIL介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系并不明確,本次研究的目標(biāo)是在腎細(xì)胞癌78

2、6-O細(xì)胞株上明確野生型 VHL基因在 TRAIL介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法:選用腎細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株、單克隆攜帶野生型 VHL基因全長 DNA的786-O/VHL細(xì)胞以及單克隆攜帶 VHL基因不同類型突變 DNA的786-O細(xì)胞,采用不同濃度的人重組 TRAIL和40ug/ml的TRAIL作用不同的時(shí)間,利用MTT和流式細(xì)胞術(shù)來檢測上述細(xì)胞株對 TRAIL介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性以及野生型 VHL基因是否具有提高

3、786-O細(xì)胞對 TRAIL敏感性的能力。RT-PCR和Western-Blot用于分析死亡受體 DR4、DR5以及凋亡抑制蛋白 c-FLIP(L)在轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達(dá)水平。為了準(zhǔn)確闡明 c-FLIP(L)和TRAIL介導(dǎo)786-O/VHL細(xì)胞凋亡的相關(guān)性,用脂質(zhì)體2000將 c-FLIP(L)轉(zhuǎn)染到對 TRAIL敏感的786-O/VHL細(xì)胞中,觀察高表達(dá)的c-FLIP(L)和TRAIL敏感性的關(guān)系。同時(shí)利用DR4和DR5的拮抗抗體來觀察

4、兩種死亡受體和野生型 VHL基因的關(guān)系。
　　結(jié)果:MTT檢測表明表達(dá)野生型 VHL基因的786-O/VHL細(xì)胞對 TRAIL介導(dǎo)的凋亡敏感,且存在劑量和時(shí)間依賴性,其余細(xì)胞株表現(xiàn)出對 TRAIL耐受。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明:TRAIL(40ng/ml)處理24h后786-O/VHL細(xì)胞和786-O細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率分別為30％和9％(P<0.05),處理72h后凋亡的比率分別為50％和10％(P<0.01)。RT-PCR和Weste

5、rn blot檢測表明,相對于對 TRAIL耐受的786-O細(xì)胞,表達(dá)野生型 VHL基因的786-O/VHL細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平 DR4的表達(dá)顯著上調(diào), DR5和c-FLIP(L)的表達(dá)顯著下降。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后高表達(dá) c-FLIP(L)的786-O/VHL細(xì)胞從 TRAIL敏感轉(zhuǎn)變?yōu)門RAIL耐受(P<0.05)。為了進(jìn)一步證實(shí) DR4和FR5的表達(dá)水平變化與 TRAIL敏感性的相互關(guān)系,利用DR4和DR5拮抗抗體分別特異性地阻斷 DR4和

6、DR5介導(dǎo)的TRAIL信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn):DR5被阻滯后,786-O/VHL細(xì)胞仍然對 TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感;而DR4被阻滯后,786-O/VHL細(xì)胞從對 TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感轉(zhuǎn)換為耐受(P<0.05);同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用DR4和DR5的拮抗抗體,其結(jié)果與單獨(dú)阻斷 DR4的結(jié)果相似(P<0.05)。
　　結(jié)論:相對于 TRAIL耐受的786-O細(xì)胞,表達(dá)野生型 VHL基因的786-O/VHL細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高了死亡

7、受體 DR4的表達(dá)和降低了凋亡抑制蛋白 c-FLIP(L)的表達(dá)。應(yīng)用DR4拮抗劑和高表達(dá)的c-FLIP(L)基因后的786-O/VHL細(xì)胞從 TRAIL敏感轉(zhuǎn)變?yōu)門RAIL耐受。上述的結(jié)果闡明了野生型 VHL基因可以使 TRAIL抵抗的786-O細(xì)胞敏感化,其他突變類型的VHL沒有類似作用。并且 VHL基因?qū)?86-O細(xì)胞后的DR4受體表達(dá)水平上升和c-FLIP(L)表達(dá)水平下調(diào)是導(dǎo)致786-O/VHL細(xì)胞對 TRAIL敏感的重要分

8、子機(jī)制。
　　第二部分 綜述
　　VHL-HIF-VEGF信號通路和腎細(xì)胞癌
　　VHL基因定位于染色體3p25～26,其產(chǎn)物 pVHL與一些信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子、氧化磷酸化的調(diào)控有關(guān)。VHL基因的失活可導(dǎo)致 VHL-HIF-VEGF信號通路異常,這與腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。VHL基因的失活機(jī)制主要包括基因突變,雜合性缺失和甲基化。針對 VHL-HIF-VEGF信號通路的靶向治療現(xiàn)已在臨床上廣泛的應(yīng)用。通